不同添加物对金针菇几种胞外酶活性的影响

宋 琪 王烁翔 于鲁萌

（烟台大学生命科学学院，山东烟台264005）

金针菇Flammulina velutipes又名金菇、构菌、朴蕈等。金针菇子实体由细长而脆嫩的菌柄和形似铜钱的菌盖组成，呈乳白色或金黄色，盖滑，柄脆，是世界上产量最高的食用菌之一。金针菇具有食疗保健的药用价值。有关金针菇的遗传育种[1]、同工酶[2]、生物活性物质开发[3]、栽培技术[4]及液体培养[5]等研究已有报道，而在其固体培养条件下的特性及胞外酶活性的研究则报道较少。金针菇的主要栽培基质有木屑、棉子壳、废棉渣、玉米芯，麦草、稻草秸秆等。为促进主料的栽培利用，通常添加不同辅料改变主料的碳氮比和微量元素的含量，以适应不同食用菌对主料营养的利用[6]。研究是以棉子壳为主要栽培基质辅以不同添加物探讨了金针菇在固体培养基上培养时的特性及其胞外酶的活性变化，确定不同添加物对各种胞外酶分解棉子壳中各种营养物质影响的差异，在实际应用中对进一步提高栽培技术有一定的意义。

1 材料与方法

1.1试验材料金针菇江都18，购自江苏天达食用菌研究所。羧甲基纤维素钠、木聚糖、果胶和半乳糖醛酸为Sigma公司产品，定性滤纸为杭州宫阳特种纸厂生产，其它药品多为国产分析纯。培养基a：棉子壳100%；培养基b：棉子壳90%，淀粉10%；培养基c：棉子壳 98.6%，石膏1%，K2HPO4、KH2PO4各0.2%；培养基d：棉子壳99.8%，尿素0.2%。

1.2栽培方法采用瓶栽方法，按上述培养基配方配比，每瓶折合干料重90 g。根据配方按料水比1∶1.4将培养基拌匀后，装入500 mL罐头瓶。灭菌、接种、栽培管理等方法按常规方法[7]。

1.3测定方法

1.3.1 酶活测定 在金针菇生长的不同阶段：①接种后10 d；②接种后16 d；③接种后22 d；④接种后28 d；⑤原基期；⑥幼菇期；⑦开伞期；⑧采收后第6天，取每种培养基各三瓶，将培养基倒出后充分混匀，取20 g加100 mL纯净水20℃浸提4 h，八层纱布过滤后，1400×g离心10 min，上清液即为粗酶液，另外每种培养基各取20 g在80℃恒温箱中烘至恒重。

羟甲基纤维素酶（CMC）、滤纸纤维素酶（FP）参照文献[8]的方法；淀粉酶、果胶酶参照文献[9]的方法；β-葡萄糖苷酶、半纤维素酶（HC）、漆酶和过氧化物酶分别参考文献[10-13]的方法。每个处理重复3次。

1.3.2 菌丝生长速度 菌丝生长至瓶肩处开始划线，每五天划一次，用十字划线法计算其生长速度。

1.3.3 组分分析计算方法 培养基失重和呼吸消耗参照文献[14]的方法。绝对生物学效率（%）=子实体干重（g）/培养基干重（g）×100。

2 结果与分析

2.1棉子壳培养基中不同添加物对金针菇三种生物学性状的影响

2.1.1 对金针菇菌丝生长速度的影响 由表1可知在不同培养基中，金针菇从接种到菌丝长满瓶所需要的天数分别为33、31、32、32 d，添加了淀粉的培养基b菌丝生长速度最快，添加了尿素和石膏的c、d培养基菌丝长势次之，没有添加物的培养基a菌丝生长的最慢。说明这些添加物能够促进金针菇菌丝的生长。

2.1.2 绝对生物学效率与呼吸消耗的影响 金针菇在四种培养基中生长40～50 d，可以长出子实体并获得第一潮菇，据此可得第一潮菇的绝对生物学效率。在培养基a上生长时培养基失重19.20%，其中5.02%转化为子实体生物量；在培养基b上生长时培养基失重19.09%，其中4.37%转化为子实体生物量。在培养基c上生长时培养基失重24.22%，其中6.31%转化为子实体生物量。在培养基d上生长时培养基失重20.11%，其中4.58%转化为子实体生物量。添加尿素的培养基c的金针菇绝对生物学效率最高，为6.31%，高于没有添加物的培养基a。添加淀粉的培养基b和添加石膏及矿质元素的培养基d的金针菇绝对生物学效率没有多大差异，分别为4.37%和4.58%，明显比培养基a要低。

表1 不同培养基对金针菇绝对生物学效率与呼吸消耗的影响

2.2棉子壳培养基中不同添加物对金针菇八种胞外酶活性的影响

2.2.1 不同添加物对CMC酶活性的影响 由图1可知在菌丝营养生长阶段（第10～22天），添加淀粉的培养基b、添加尿素的培养基c、添加石膏的培养基d都能提高CMC酶在棉子壳培养基中的酶活性，但在菌丝生长第22天一直到栽培结束，这三种添加物对酶活性大小的影响无明显差异，且变化趋势具有较好的一致性。只有添加尿素的培养基d在菌丝生长22 d后，CMC酶高些。在整个栽培过程中，四种培养基中的CMC酶的平均酶活性在子实体生长发育阶段，高于菌丝营养生长阶段。

图1 不同添加物对CMC酶活性的影响

2.2.2 不同添加物对HC酶活性的影响 由图2可知，不同添加物对HC酶在整个栽培过程中的变化趋势影响不大，但对酶活性大小有一定的影响。在四种培养基中，均是子实体生长发育阶段平均酶活性高于菌丝营养生长期。不同添加物只是影响了HC酶在子实体生长发育阶段酶活性峰值出现的先后顺序和平均酶活性大小。加入淀粉的培养基b，所测得的HC酶活性高峰在原基期；加入尿素的培养基c，HC酶活性峰值出现在幼菇期，其原基期以后一直到栽培就结束，酶活性都高于没有添加物的培养基a；加入石膏的培养基d，在原基期和开伞期出现两个酶活性峰值，且从接种后28 d，一直到栽培结束，HC酶活性明显高于没有添加物的培养基a。

图2 不同添加物对HC酶活性的影响

2.2.3 不同添加物对FP酶活性的影响 由图3可知，在整个栽培过程中，同一时期的FP酶在四种培养基中的酶活性大小，差异不明显，尤其是在菌丝生长16 d后，一直到栽培结束，酶活性大小差异并不明显。只有在菌丝生长初期（10 d左右），相比较只有棉子壳的培养基a，添加淀粉和尿素培养基，提高了FP酶的活性。总体来说，虽然不同添加物，在一定程度上影响了不同阶段FP酶活性大小，但并不影响酶活性的大致变化趋势。

2.2.4 不同添加物对β-葡萄糖苷酶活性的影响 由图4可知，β-葡萄糖苷酶在四种培养基中的酶活性变化趋势大致相同。从接种后10 d到栽培结束，β-葡萄糖苷酶变化差异不大，子实体生长发育阶段，平均酶活性稍高于菌丝生长期。只有在菌丝生长前期（10 d左右），添加淀粉和尿素提高了β-葡萄糖苷酶在棉子壳培养基中的酶活性，在菌丝生长28 d一直到子实体成熟期添加了淀粉的培养基b和添加了石膏的培养基d中，β-葡萄糖苷酶活性都低于没有添加物的培养基a。

2.2.5 不同添加物对果胶酶活性的影响 由图5可知，在金针菇菌丝营养生长前期（第10～22天）果胶酶活性较高。添加石膏或淀粉能提高果胶酶在此阶段的活性，但加入尿素反而使果胶酶在此阶段的活性偏低，但在菌丝营养生长后期（第22天）一直到栽培结束，果胶酶在四种培养基中的活性变化趋势一致性比较好，同一栽培时期不同培养基的酶活性大小无明显差异，同一种培养基在这段时间内果胶酶活性大小更无明显差异。

2.2.6 不同添加物对淀粉酶活性的影响 由图6可知淀粉酶在四种培养基中的活性变化趋势大致相同，即菌丝营养生长阶段活性相对较高，子实体生长发育阶段活性较低。总体上随着栽培时间的延长，淀粉酶活性逐渐下降，而且较为明显地是加入淀粉、尿素或石膏能提高淀粉酶在整个栽培阶段的酶活性，尤其是添加淀粉可显著提高淀粉酶的活性。

图3 不同添加物对FP酶活性的影响

图4 不同添加物对β-葡萄糖苷酶活性的影响

图5 不同添加物对果胶酶活性的影响

图6 不同添加物对淀粉酶活性的影响

2.2.7 不同添加物对过氧化物酶活性的影响 由图7可知过氧化物酶在四种培养基中的活性变化呈时升时降的趋势，但在整个栽培阶段平均酶活性呈下降趋势，由培养基a和b的变化趋势可以看出，添加淀粉对过氧化物酶活性大小和变化趋势影响最小，添加石膏的培养基d中，过氧化物酶活性在整个栽培阶段低于没有添加物的培养基a。由图7还可以看出，从原基期到开伞期过氧化物酶活性最低，有时酶活性降为0。

2.2.8 不同添加物对漆酶活性的影响 由图8可知，金针菇菌丝营养生长阶段添加石膏的培养基d漆酶活性最低。不同培养基的漆酶活性都有高峰出现。培养基a和培养基d在原基期达到活性高峰。添加尿素使得培养基c在菌丝生长22 d达漆酶活性高峰。添加淀粉的培养基d漆酶活性在整个过程中呈递降趋势。在菌丝生长10 d和28 d酶活性较高。在子实体成熟期四种培养基中漆酶活性同时降到最低值，接近为0。子实体采摘后漆酶活性又开始上升。但总体来说不同添加物对漆酶活性变化趋势没多大影响。只是不同程度上影响到漆酶活性大小及酶活性高峰出现的早晚。

图7 不同添加物对过氧化物酶活性的影响

图8 不同添加物对漆酶活性的影响

3讨论

向棉子壳中添加淀粉、石膏，不能提高金针菇的绝对生物学效率，而向棉子壳中添加一定量的尿素，既能促进金针菇菌丝生长，也能提高绝对生物学效率。这可能与氮素有利于菌丝体细胞中蛋白质、核酸、酶和辅酶等生物大分子合成，加速细胞的代谢水平，促进菌丝体对生物大分子的分解、吸收、利用和转化有关。据此可推测，在生产实践中，当以棉子壳为主料栽培金针菇时，可添加尿素以达增产目的。

金针菇具有完整的纤维素酶系，金针菇在四种培养基上生长期间，培养基中始终存在CMC酶、FP酶和β-葡萄糖苷酶活性，这不同于人们对玉覃[15]和银耳[16]等的研究，而与灵芝[17]相似，这说明金针菇胞外纤维素酶系完整。这为金针菇分解纤维素奠定了生理基础。金针菇的胞外CMC酶、FP酶、β-葡萄糖苷酶在子实体生长发育阶段具有相对较高的酶活性，这种现象与人们对双孢蘑菇[18，19]、香菇[20，21]、四孢蘑菇[22]等的一些研究相似。对此的解释是：金针菇原基形成后，随着菌丝细胞内储藏的糖原、海藻糖[23]和菌丝体蛋白[24]等的消耗，内源性营养物质已不能满足子实体迅速生长发育的需要。纤维素酶活性的增加可加速其对培养基中纤维素降解，满足子实体迅速生长发育对物质和能量的需求。漆酶和过氧化物酶活性均随栽培时间的延长逐渐下降，这与金顶侧耳、巴西蘑菇等食用菌的情况相似[25，26]。这表明木质素的降解可能随食用菌栽培时间的延长逐渐减少。

金针菇的胞外淀粉酶和果胶酶都是在菌丝生长阶段活性较高，子实体发育期活性较低，据此可推测，淀粉和果胶在菌丝生长期的降解量可能大于子实体的生长发育期，这些胞外酶主要在菌丝生长阶段发挥作用，对子实体的形成与发育影响不大。

由图1～8可知，不同添加物所形成的不同营养环境对金针菇胞外酶活性大小影响较大，对酶活性的变化趋势影响较小，这一结论与人们对香菇[27]胞外酶活性的研究结果相似。这表明，在能够长子实体的培养基中，菌丝体所处的营养环境对酶的活性大小影响较大，而对酶的活性变化趋势影响较小。