来源于Cronobacter universalis的植酸酶酶学性质的研究

付晓燕，韩红娟，朱 波，王 波，彭日荷 ，姚泉洪

（上海市农业科学院生物技术研究所，上海 201106）

来源于Cronobacter universalis的植酸酶酶学性质的研究

付晓燕，韩红娟，朱 波，王 波，彭日荷 ，姚泉洪

（上海市农业科学院生物技术研究所，上海 201106）

按照毕赤酵母（Pichia pastoris）对密码子的选择偏向性，对来源于细菌（Cronobacter universalis）的植酸酶基因（以下命名为CuPhyS）进行了密码子优化改造，合成并且作为外分泌蛋白成功地在毕赤酵母GS115里表达，CuPhyS的蛋白分泌量可积累到45μg/mL。酶学性质研究表明：该酶的最适pH为4.0，最适温度为50℃，在pH 3.0—12.0时该酶比较稳定，在50℃下热稳定性较高；以植酸钠作为底物，Mg2＋对酶活有一定的激活作用，Cu2＋对酶活有一定的抑制作用；该酶还具有良好的抗胰蛋白酶水解的能力和部分抗胃蛋白酶水解的能力。

植酸酶；Cronobacter universalis；毕赤酵母；酶学性质

植酸酶（Phytase，E.C.3.1.3.8）是一种能降解植酸及其盐类的水解酶。常用于动物的饲料添加剂，存在于植物、动物、真菌以及微生物中。植酸酶的应用可以提高植物性饲料中磷的利用率，减少粪便中磷的排放量，从而降低环境中的磷污染，并可降低植酸的抗营养作用［1］。在富含磷的油料、谷物等植物性饲料中，有80%以上的磷是以植酸或植酸盐的形式存在［2］。迄今，植酸酶的研究已比较全面，主要集中在识别植酸酶的种类，改善植酸酶的酶学特性，研究其催化机制及其增加植酸酶产量［3］。植酸酶作为一种饲料添加剂，有着广泛的应用前景。但由于天然来源的植酸酶或者提取困难、或者分泌量太低、或者成本太高，难以满足现实实验和生产的需要。构建基因工程菌作为一个微型生物反应器来获得能高效表达植酸酶的菌株，成为解决这一问题的途径。

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是目前使用最广泛的外源蛋白真核表达系统，其外源蛋白质的表达量可达到g/L的水平，实现植酸酶基因在毕赤酵母中的高效表达将大幅度提高植酸酶的发酵效价，进一步降低植酸酶生产成本。本研究根据密码子偏好性合成了一个来源于Cronobacter universalis的新型植酸酶基因CuPhyS，成功地在毕赤酵母中实现了分泌和表达，并对表达产物的酶学特性进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒

大肠杆菌（E.coli）DH5a为本研究室保存；巴斯德毕赤酵母菌株GS115（His－，Mut＋）购自Invitrogen公司；表达载体pYPX88（基因登录号AY178045）由本研究室构建。

1.1.2 酶和试剂

限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、Protein marker均购自Takara公司；脱糖基化酶Endoglycosidase H购自Biolab公司；植酸钠（肌醇六磷酸十二钠）购自Sigma；胃蛋白酶和胰蛋白酶以及其他试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 培养基

2018第十六次全国中西医结合学会耳鼻咽喉科学术年会暨中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志第七届第二次编委会议纪要（高娜 钱晓青 何子彧 韩朝）5∶插页

LB培养基参见分子克隆［4］，YPD、BMGY、BMMY培养基均根据Invitrogen公司操作手册配置。

1.2 方法

1.2.1 酵母表达载体构建

根据编码C.universalis植酸酶成熟蛋白的基因序列，按照毕赤酵母密码子的偏爱性，在不改变其氨基酸序列的前提下进行序列改造，并使GC含量保持适中。利用PCR方法［5］成功地将来源于C.universalis的新型植酸酶基因（登录号：CAKX01000221.1）的序列合成。将优化的基因连接到毕赤酵母表达载体pYPX88上，筛选挑出阳性克隆子，得到毕赤酵母植酸酶表达载体pYPX88-CuPhyS。

1.2.2 酵母的电击转化

用5 mL YPD液体培养基培养毕赤酵母GS115菌，30℃培养过夜。取过夜培养菌液1 mL接种于100 m L新鲜的YPD液体培养基，30℃培养至OD600＝1.6—1.8，然后根据Invitrogen手册的方法制备毕赤酵母感受态细胞，将重组质粒pYPX88-CuPhyS线性化后的DNA电击转入毕赤酵母感受态细胞（电压175 kV，电阻400Ω，时间9.00ms）。转化液冰置培养5min，取100μL涂布于SD-his固体平板上，30℃培养72 h至转化子长出。

1.2.3 重组酵母的诱导表达

将活性较强的菌液接种于100 mL BMGY（含1%甘油）中，28℃剧烈震荡培养至OD600值约5.0，离心收集菌体，加入20 mL诱导培养基BMMY（含1%甲醇）悬浮菌体，继续28℃诱导培养，每隔24 h添加一次甲醇。每隔6 h取样检测各菌株上清液的植酸酶活性，从中筛选出表达植酸酶的转化子。

根据酶活检测方法［6］，植酸酶酶活单位（U）定义为：在37℃和pH 5.5的条件下，1 min内从5.0 mmol/L的植酸钠溶液中水解释放出1μmol无机磷所需的酶量为1个酶活单位。

1.2.4 表达产物的SDS-PAGE分析及脱糖基化处理

取上清酶液1.5 mL流过用缓冲液A（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，10 mmol/L咪唑和300 mmol/L NaCl）平衡好的镍柱（Ni2＋-NTA agarose affinity column），然后用洗涤液B（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，20 mmol/L咪唑和300 mmol/L NaCl）洗涤，最后用洗脱液C（50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，250 mmol/L咪唑和300mmol/LNaCl）洗脱。其表达产物取8μL进行SDS-PAGE分析。同时取9μL上清液进行脱糖基化处理，建立如下反应体系：9μL上清液加1μL 10×Glycoprotein变性缓冲液，100℃煮沸10 min后使其变性，加1.0μL 10×G5缓冲液、1μL Endo H，37℃条件下反应1 h。

1.2.5 表达植酸酶酶学性质的测定

（1）最适pH和pH稳定性的测定：用不同pH缓冲液调节底物pH。酶液在37℃与不同pH的底物反应30 min后，相对活性最高所对应的pH为最适pH。pH稳定性是在不同pH的缓冲液条件下，37℃处理24 h，然后在最适条件下（最适pH，37℃，反应30 min）测定酶活。（2）最适温度和热稳定性的测定：最适温度是用0.2 mol/L NaAc-HAc（pH 4.0）稀释好的植酸酶液与底物0.75 mmol/L植酸钠在不同的温度下反应30 min后测定相应的酶活性。对于温度稳定性，是将稀释好的酶液分别在50℃、60℃和70℃水浴分别加热不同时间后立即冰置冷却，在37℃，pH 4.0条件下反应30 min测定酶活。（3）不同金属离子对植酸酶的影响：在含0.75 mmol/L植酸钠底物的NaAc-HAc缓冲液（pH 4.0）中分别加入不同金属离子、巯基化合物、变性剂和金属螯合剂，在37℃，pH 4.0反应30 min，以未加入金属离子和其他化学试剂的缓冲液做空白对照。（4）胃蛋白酶和胰蛋白酶对植酸酶影响的测定：用相应的0.2 mol/L Gly-HCl（pH 2.0）和0.2 mol/L Tris-HCl（pH 7.5）分别稀释好的胃蛋白酶和胰蛋白酶液与植酸酶按一定重量比例（蛋白酶/植酸酶w/w：1/500、1/250、1/100、1/1、100/1、250/1、500/1、1 000/1）混合，37℃下分别处理4 h，然后在pH 4.0条件下反应30 min再测定酶活性，以未处理的初酶活性作对照。

2 结果与分析

2.1 CuPhyS基因的合成和含CuPhyS基因重组表达载体的构建

综合影响基因表达的各种因素，在不改变氨基酸序列的前提下对植酸酶基因进行改造，共改变了266个碱基，G＋C含量由原来的46.8%提高到50.6%，基本符合毕赤酵母G＋C的含量特征。

经过改造的CuPhyS基因通过Xho I和Sac I位点定向插入酵母表达载体pYPX88，与其中的α-因子信号肽编码序列的3’端融合，得到重组表达载体pYPX88-CuPhyS（图1），通过酶切鉴定证实该重组质粒构建正确。BLAST比对结果显示：CuPhyS基因和野生型基因有80%的同源性（图2）。

图1 重组表达质粒pYPX88-CuPhyS图谱Fig.1 Themap of recombinant expression plasm id pYPX88-CuPhyS

图2 合成基因CuPhyS序列与野生型序列的同源性比对Fig.2 Sequence hom ology alignm ent between synthetic and w ild genes

2.2 重组植酸酶基因在毕赤酵母中的表达

SDS-PAGE分析结果表明（图3），毕赤酵母表达的植酸酶其表观分子量在49—58 kD，比从氨基酸序列推断出的理论分子量（约46.5 kD）大，证明植酸酶基因不仅能有效分泌表达，而且表达产物还能进行蛋白质翻译后的修饰-糖基化。另外，培养液中除了植酸酶蛋白外，其他蛋白质几乎不可见。将表达外源蛋白进行脱糖基处理后，分子量约为45 kD，与生物信息学预测理论分子量相当。

2.3 重组植酸酶CuPhyS的酶学性质分析

表达的植酸酶各种酶学性质测定结果表明：（1）其最适pH为4.0，更偏酸性。在pH 3.5—5.0，植酸酶的相对活性均在70%以上。在pH 3.5—4.5，植酸酶的相对活性稳定在90%以上（图4-A）。因为动物胃里的pH为2.5，小肠pH为4.0—5.5，所以该重组植酸酶很适合动物食用，在胃和小肠中均能发挥较高活性。另外，该植酸酶在pH 10—13.0均有活性，但当pH小于1.0或大于13.0时，酶活力迅速下降（图4-B）。（2）不同温度下酶活性的测定结果表明，该酶的最适温度为50℃，在30—65℃，植酸酶的相对活性在50%以上（图5-A）。60℃条件下处理10 min后，CuPhyS的剩余活性为20%；而70℃条件下处理2 min后CuPhyS的剩余活性仅为20%，处理10 min后，该酶的剩余活性几乎为0，说明该酶耐热性较差（图5-B）。（3）植酸酶活性的发挥受到很多金属离子及化学试剂的影响。在酶促反应体系中加入不同的金属离子和化学试剂，分别测定酶活性，结果表明，金属离子K＋、Na＋、Cr2＋、Ni2＋、Li＋、Ca2＋、NH4＋、Mg2＋、Ba2＋、Co2＋、Mn2＋、巯基化合物DTT及金属螯合剂EDTA对CuPhyS有一定的激活作用，其中Ca2＋、NH4＋、Ba2＋、DTT及EDTA对CuPhyS的激活作用比较明显；Pb2＋、Zn2＋、Cu2＋、Al3＋和变性剂SDS对CuPhyS的酶促反应均有不同的抑制作用，Cu2＋和Zn2＋的抑制力较强，当反应体系中加入变性剂SDS时，酶已基本失去活性（图6）。（4）胃蛋白酶和胰蛋白酶对该酶的影响结果如图7所示：用胃蛋白酶处理植酸酶CuPhyS，30 min后酶活性剩余20%，用胃蛋白酶处理90 min后，酶活性基本丧失。由于胃蛋白酶处理是在酸性条件下进行的，可能是酸性环境对酶活性的影响与蛋白酶共同作用的结果。胰蛋白酶对CuPhyS的活性几乎无影响，用胰蛋白酶处理180 min后酶活性为60%，说明植酸酶CuPhyS具有抗胰蛋白酶水解的能力。

图3 表达植酸酶脱糖基前后的SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE of expressed phytase before and after deglycosy lated

图4 重组植酸酶CuPhyS的最适pH（A）和pH稳定性（B）Fig.4 The optimum pH（A）and pH stability（B）of recom binase CuPhyS

图5 重组植酸酶CuPhyS的最适温度（A）和热稳定性（B）Fig.5 The optimum tem perature（A）and thermal stability（B）of recombinase CuPhyS

图6 各种金属离子和化学试剂对CuPhyS活性的影响Fig.6 Effects of variousm etal ions and chem icals on activity of CuPhyS

图7 胰蛋白酶和胃蛋白酶处理对CuPhyS活性的影响Fig.7 Effects of trypsin and pepsin treatments on activity of CuPhyS

3 结论与讨论

按照表达宿主的密码子偏爱性对优化外源基因的密码子进行改造，是提高外源基因表达量的一种有效方法［7-8］。毕赤酵母密码子使用偏爱性尤为明显，如Pro的密码子CCG、Gly的密码子GGG、Ala的密码子GCG等在毕赤酵母高表达基因中的使用频率为零，当外源基因中含有这些密码子时将严重制约其在毕赤酵母中的表达。本研究将CuPhyS基因中所有低偏爱性密码子及大部分中等偏爱性密码子替换为高偏爱性密码子，使其在毕赤酵母表达系统实现了高效表达。本研究已经获得一个来源于C.universalis并且成功表达在毕赤酵母的新型植酸酶蛋白，将该酶应用于大规模的工业生产将会极大程度地降低生产成本。

毕赤酵母表达系统会使外源蛋白进行糖基化。如大多数真菌表达的植酸酶都会有不同程度的糖基化，糖基化便利了蛋白空间结构的折叠，从而增加了蛋白的稳定性［9］。对于植酸酶，糖基化主要是增加了其对温度的稳定性，而对最适pH和最适温度则没有影响［10］。脱糖基化处理结果表明，该酶蛋白为糖蛋白，不同程度的糖基化造成了其分子量的差异。而本研究中该分子量有差异的重组蛋白CuPhyS在酶学性质上几乎没有差异。

植酸酶活性的发挥受到很多金属离子的影响。Zn2＋和Cu2＋等多价离子可和酶底物植酸发生络合作用，形成难溶的复合物，降低了植酸的有效浓度，从而降低酶的活性。Mg2＋能催化植酸的水解，当它存在时植酸酶的活性得以提高。本试验还证明了Ca2＋、Mn2＋和EDTA也能激活植酸酶的活性。

目前，植酸酶在饲料应用中主要存在三个方面的问题，其中主要问题是植酸酶的pH适用范围、植酸酶的热不稳定性以及对胃、胰蛋白酶的耐受性［11］。本试验通过酶学性质的比较分析表明，来源于C.universalis的植酸酶具有较高的耐热性，很好地解决了饲料生产过程中因高温制粒而造成的植酸酶活性损失较多的问题；其次，该酶还具有广泛的pH耐受性，pH 1.5—6.5都能保持40%以上的酶活，说明该酶在动物消化道内的适应性较强。对重组植酸酶的抗蛋白酶能力的研究发现其具有一定的抗胰蛋白酶的能力，但抗胃蛋白能力较弱。与报道的非重组酶抗蛋白酶性质［12］不同，其原因正在进一步研究。如何使植酸酶具有高温耐受性并且能在动物正常体温和肠胃pH条件下发挥最大活力，将是生产植酸酶制剂需要解决的重要问题。另外，随着植酸酶应用范围的扩展，目前在食品加工、肌醇和肌醇单磷酸盐料添加剂生产等方面植酸酶也有应用，根据本研究植酸酶的优缺点，期望在不同的领域开发应用。

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（责任编辑：程智强）

The enzymological property of phytase from Cronobacter universalis

FU Xiao-yan，HAN Hong-juan，ZHU Bo，WANG Bo，PENG Ri-he ，YAO Quan-hong
（Biotechnology Research Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai201106，China）

According to the selection bias of Pichia pastoris toward a codon，a novel phytase gene（CuPhyS）from Cronobacter universalis was synthesized via codon optimization and successfully expressed as exocrine protein in P.pastoris GS115，and the protein secretion yield of CuPhyS could accumulate to approximately 45μg/mL.The research of the enzymological property showed that the optimal conditions for the phytase were pH 4.0 and 50℃，and itwas comparatively stable within pH 3.0—12.0 and had a good thermal stability at50℃.To a certain extent the enzyme activity was activated by Mg2＋and inhibited by Cu2＋.The phytase also had a good ability to resist hydrolyzation by trypsin and partial hydrolyzation by pepsin.

Phytase；Cronobacter universalis；Pichia pastoris；Enzymological property

S816.3

：A

1000-3924（2017）02-001-06

10.15955j.issn1000-3924.2017.02.01

2016-02-22

付晓燕（1979—），女，硕士，助理研究员，研究方向：植物微生物基因工程。Tel：13564368816，E-mail：fuxiaoyan0211＠163.com

，彭日荷E-mail：pengrihe69＠yahoo.com；姚泉洪E-mail：yaoquanhong65＠yahoo.com