好氧反硝化细菌LKX-1菌株培养基与发酵条件的优化

赵健宇，刘立立，兰时乐，杨友才

（湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128）

好氧反硝化细菌LKX-1菌株培养基与发酵条件的优化

赵健宇，刘立立，兰时乐，杨友才

（湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128）

采用单因素试验法研究了蒙氏假单胞菌LKX-1菌株的发酵培养基组成和发酵条件，并采用正交试验法对发酵条件进行了优化。结果表明：适宜的发酵培养基配方为：麦芽糖 2.0%，酵母粉 2.0%，KH2PO40.15%，MgSO4·7H2O 0.10%；最适发酵条件为：发酵温度30℃，接种量1.0%，初始pH值7.0，装液量100 mL/瓶（三角瓶容量250 mL），发酵时间24 h；在此条件下，发酵液中活菌数可达4.5×1014CFU/mL。

好氧反硝化细菌；培养基；发酵条件；优化

由于农村生活废水存在排放不集中、收集困难等问题，因此很难将城市生活污水处理方法向农村推广应用；加上我国大部分农村没有污水排放管网和污水处理系统，导致这些生活污水未经任何处理就直接排放到自然环境中，农村河道、地下水水体污染越来越严重，对生态环境造成了极大破坏。目前，这一问题已引起了社会的广泛关注。当前，对于农村生活废水较为成熟的处理技术主要有稳定塘处理技术[1]、人工湿地处理系统[2]、土地处理技术[3]和生物膜技术[4-5]等。尽管这些技术在实际应用中取得了一定效果，但也存在投资和处理成本较高、工艺复杂、占地面积大以及处理效果不稳定等缺点。

近年来，生物脱氮因其高效、安全、无二次污染等优点成为污水净化研究的热点。但传统的反硝化细菌基本为厌氧菌，其对生长环境和污水处理条件要求严格，制约了生物除氮技术在污水处理中的推广应用。于是，好氧反硝化菌便进入了人们的视线。好氧反硝化细菌包括泛养副球菌（Paracoccus pantotropha）、假单胞菌属的某一种（Pseudomonas spp.）和粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）、Aquaspirillum、Thauera、生丝微菌属（Hyphomicroobium）[6-9]等，这些细菌在污水脱氮处理方面已有大量应用报道[10-11]。课题组从水稻土中分离到了一株脱氮能力较强的好氧硝化细菌LKX-1[12]，笔者对其适宜的发酵培养基和发酵条件进行了初步研究，以期为该菌株在农村生活废水生物除氮处理中的应用奠定的基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株 蒙氏假单菌LKX-1（Pseudomonas monteilii LKX-1），由洞庭湖农村生态健康湖南省重点实验室分离、鉴定和保藏。

1.1.2 培养基 斜面培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，琼脂2%，pH值7.0～7.5。种子培养基：葡萄糖3%，蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NH4NO30.5%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，pH值7.0～7.5。基础发酵培养基：葡萄糖2%，蛋白胨1%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，pH值7.0～7.5。以上培养基均在121℃灭菌25 min。

1.2 试验方法

1.2.1 培 养 斜面培养：将分离得到的目的菌株接种于斜面培养基表面，在30℃恒温培养箱中培养48 h。液体种子培养：将斜面菌种接种于液体种子培养基中，30℃，180 r/min恒温振荡培养24 h，备用。发酵培养：按2%（V/V）的接种量将培养好的液体种子接入装有100 mL基础发酵培养基的250 mL三角瓶中，30℃，180 r/min恒温振荡培养。

1.2.2 发酵培养基的单因素试验 （1）碳源：改变基础发酵培养基中碳源的种类，分别加入2%的葡萄糖、乙酸钠、蔗糖、玉米淀粉、麦芽糖，其他条件不变，培养24 h后测定活菌数。（2）麦芽糖浓度：在基础发酵培养基中分别加入1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的麦芽糖，其他条件不变，培养24 h后测定活菌数。（3）氮源种类：在等氮条件下，在基础发酵培养基中分别添加硝酸铵、豆饼粉、蛋白胨、鱼粉、酵母粉，其他条件不变，培养24 h后测定活菌数。（4）酵母粉浓度：在基础发酵培养基中分别加入1.7%、2.0%、2.3%、2.6%、2.9%的酵母粉，其他条件不变，培养24 h后测定活菌数。（5）KH2PO4浓度：改变基础发酵培养基中KH2PO4浓度，分别添加0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%的KH2PO4，其他条件不变，培养24 h后测定活菌数。（6）MgSO4·7H2O浓度：在基础发酵培养基中分别添加0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%的MgSO4·7H2O，其他条件不变，培养24 h后测定活菌数。

1.2.3 发酵条件的单因素试验 （1）初始pH值：用稀酸或稀碱分别调节基础发酵培养基的初始pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，其他条件不变，培养24 h后测定活菌数。（2）接种量：将培养好的液体种子分别按0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%（V/V）的接种量接入发酵培养基中，其他条件不变，培养24 h后测定活菌数。（3）装液量：在250 mL三角瓶中分别添加80、90、100、110、120 mL的发酵培养基，其他条件不变，培养24 h后测定活菌数。（4）发酵时间：在上述得到的适宜条件下，发酵12 h后开始取样，以后每隔12 h取样一次，直到60 h后终止培养，测定活菌数。

1.2.4 发酵条件的正交优化 选择对活菌数影响较大的因素如培养基的初始pH值、接种量和发酵时间进行3因素3水平的L9（33）正交优化，正交试验因素水平见表1。

表1 发酵条件正交试验因素水平

1.3 活菌数的测定

准确吸取10 mL发酵液于90 mL带有适量玻璃珠的无菌水中，振荡10 min后，采用10倍稀释法依次稀释至10-10，分别吸取10-8、10-9、10-10这3个稀释度的稀释液0.1 mL于牛肉膏蛋白胨培养基平板表面，涂布均匀，于30℃下恒温培养24 h，计数平板上的菌落数。选取菌落数在30～300的稀释度平板的平均菌落数进行计算。计算公式如下：

活菌数（CFU/mL）=某一稀释度下的平均菌落数×稀释倍数×1/V。

式中，V表示接种体积（mL）。

2 结果与分析

2.1 培养基的优化

2.1.1 碳 源 微生物细胞中，含碳量占据干重的一半，因此除水分外，碳源是微生物生长过程中需求量最大的营养物质[9]。它既是细胞碳架的组成成分，也是维持细胞生命活动的的能量物质，以及代谢产物的组成成分，在配置微生物培养基时有重要的指导作用。由图1可知，不同碳源下蒙氏假单胞菌LKX-1液体发酵培养的活菌数差异较大，其中以麦芽糖为碳源时，发酵液中活菌数最多，达到2.93×1013CFU/mL。故选择麦芽糖作为蒙氏假单胞菌LKX-1发酵培养的碳源。

图1 碳源种类对蒙氏假单胞菌LKX-1发酵培养活菌数的影响

2.1.2 麦芽糖添加量 不合适的碳源浓度将影响培养基的渗透压、碳氮比等，进而影响微生物的生长、繁殖和代谢。从图2中可以看出，在一定范围内，随着麦芽糖添加量的增加，蒙氏假单胞LKX-1的活菌数逐渐降低；当麦芽糖添加量大于等于2.0%时，细菌生长受到严重影响；当麦芽糖添加量为1.0%时，活菌数最多，为2.97×1013CFU/mL。故选择麦芽糖添加量为1.0%。

2.1.3 氮源种类 氮是构成细胞生命物质蛋白质和核酸等的主要元素，通常占细胞干重的12%～15%，微生物对不同氮源的利用能力不同。由图3可知，在等氮条件下，当以酵母粉为氮源时，发酵液中活菌数最大，达到2.59×1013CFU/mL。故选择酵母粉作为蒙氏假单胞菌LKX-1发酵培养的氮源。

图2 麦芽糖添加量对蒙氏假单胞菌LKX-1发酵培养活菌数的影响

图3 氮源种类对蒙氏假单胞菌LKX-1发酵培养活菌数的影响

2.1.4 酵母粉添加量 从图4中可以看出，在一定范围内，随着酵母粉浓度的增加，发酵液中活菌数随之增加。当酵母粉添加量为2.0%时，活菌数达2.96×1013CFU/mL。酵母粉添加量超过2%时，发酵液中活菌数快速下降。原因是随着酵母粉添加量的增加，改变了培养基中的C/N，从而影响了菌株的生长繁殖。故选择酵母粉添加量为2.0%。

图4 酵母粉添加量对蒙氏假单胞菌LKX-1发酵培养活菌数的影响

2.1.5 KH2PO4添加量 无机盐或矿质元素的主要作用之一是为微生物提供碳、氮源以外的各种重要元素，在细胞内起着调节酶促反应、维持细胞膜平衡以及渗透压的作用。盐浓度的大小影响着微生物的呼吸速率以及酶活性的大小[13]。磷是细胞中核酸和蛋白质的必要成分，也是细胞中三磷酸腺苷的组成成分。适量的磷有利于促进糖代谢，但磷含量过低或过高，都会影响微生物的生长和代谢。从图5中可以看出，在一定范围内，随KH2PO4浓度的增加，发酵液中活菌数也随之增加；当KH2PO4浓度为0.15%时，活菌数最多，达到3.03×1013CFU/mL；当浓度超过0.15%时，活菌数显著下降。故选择KH2PO4添加量为0.15%。

图5 KH2PO4添加量对蒙氏假单胞菌LKX-1发酵培养活菌数的影响

2.1.6 MgSO4·7H2O添加量 镁离子不参与任何细胞物质的合成，但它是许多重要酶的激活剂，镁离子不但影响基质的氧化，还影响蛋白质的合成，能促进碳水化合物的新陈代谢、核酸的合成、磷酸盐的转化等。由图6可知，当MgSO4·7H2O添加量为0.10%时，活菌数达到2.85×1013CFU/mL，但当MgSO4·7H2O添加量超过0.10%，活菌数随之下降。故选择MgSO4·7H2O添加量为0.10%。

图6 MgSO4·7H2O添加量对蒙氏假单胞菌LKX-1发酵培养活菌数的影响

2.2 发酵条件的优化

2.2.1 单因素试验结果 （1）初始pH值。由图7可知，在6.0～7.5范围内，随着培养基初始pH值升高，活菌数随之增加，当培养基初始pH值为7.5时，发酵液中活菌数最大，达到4.5×1013CFU/mL。（2）接种量。接种量过少，会导致延滞期和发酵周期延长，并增加了发酵过程中杂菌污染的几率；接种量过多，会导致发酵前期营养物质消耗过快而影响发酵后期的供应，同时随着种子带入的发酵副产物也会影响微生物的生长繁殖。由图8可知，当接种量为1%时，活菌数达到6.0×1013CFU/mL。但接种量超过1%，活菌数明显下降。（3）装液量。氧气是好氧微生物生长繁殖的必需生长条件，培养基中溶氧量对菌体的生长、代谢产物的形成都会产生影响。工业发酵生产中，往往通过增加通风量和提高搅拌速度来满足菌体对氧气的需求；而实验室条件下，则是通过装液量和摇床转速来调节培养液中的溶氧量。装液量大，三角瓶中相对空间较小，培养液中溶解氧含量低；装液量过小，虽然能提高培养液中的溶氧量，但由于培养基中的水分蒸发速度过快会使培养液中代谢副产物浓度提高，从而影响微生物的生长。于是，适宜的装液量对细菌发酵也很关键。由图9可知，在250 mL三角瓶中装100 mL培养液，活菌数最多，达到5.4×1013CFU/mL。（4）发酵时间。由图10可知，在最优培养基配方以及最佳接种量和装液量的条件下，蒙氏假单胞菌LKX-1发酵培养的最适培养时间为24 h时，活菌数最高，达到6.6×1013CFU/mL。当发酵时间超过24 h时，活菌数显著下降。这可能是因为培养时间过长，培养液中营养物质消耗、代谢副产物积累和菌体生长环境如pH值等的改变，导致菌体生长减缓甚至死亡，加上蒙氏假单胞菌是非芽孢菌，对环境中各种因素较为敏感，由此加速了蒙氏假单胞菌菌体的死亡。

图7 初始pH值对蒙氏假单胞菌LKX-1发酵培养活菌数的影响

图8 接种量对蒙氏假单胞菌LKX-1发酵培养活菌数的影响

图9 装液量对蒙氏假单胞菌LKX-1发酵培养活菌数的影响

2.2.2 正交试验结果 从表2中极差数据可以看出，各因素中对活菌数影响最大的是发酵时间，其次是接种量，而初始pH值的影响最小；由表2中各影响要素的均值大小可知，发酵条件的最佳优化组合为A1B2C2，即发酵时间为24 h，接种量为1.0%，初始pH值为7.0。在最佳发酵条件下，菌株LKX-1的活菌数为4.5×1014CFU/mL，其活菌数比优化前提高了近15倍。

图10 发酵时间对蒙氏假单胞菌LKX-1发酵培养活菌数的影响

表2 发酵条件正交试验结果

3 小结与讨论

反硝化细菌越来越受到科研工作者的重视，其在工业废水、养殖废水和农村生活废水等污水处理领域的应用逐渐成为研究的热点。各种反硝化细菌具有不同的好气性，培养基营养成分和培养条件对反硝化细菌的生长也有较大影响[14-15]。张玉芹等[16]研究了好氧反硝化细菌B88和B237的发酵条件，它们在YB培养基中生长的菌体浓度分别为6.1×108和1.54 ×108个/mL；吴美仙等[17]分离到1株具有较强反硝化作用能力的菌株D2，在最适培养条件下最高生长浓度为4.2×105个/mL。该研究以从水稻田中分离的好氧反硝化细菌蒙氏假单胞菌LKX-1为菌种，采用单因素试验法研究了其发酵培养基组成和发酵条件，并采用正交试验法对发酵条件进行了优化，获得适宜的发酵培养基配方为：麦芽糖 2.0%，酵母粉 2.0%，KH2PO40.15%，MgSO4·7H2O 0.10%；最适发酵条件为：发酵温度30℃，接种量为1.0%，初始pH值 7.0，装液量100 mL/瓶（三角瓶容量250 mL），发酵时间24 h。在此条件下，发酵液中活菌数最高可达4.5×1014CFU/mL。

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（责任编辑：成 平）

Studies on the Culture Medium and Fermentation Conditions of the Aerobic Denitrifier LKX-1

ZHAO Jian-yu，LIU Li-li，LAN Shi-le，YANG You-cai

（College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC）

The composition of fermentation medium and fermentation conditions were studied by using single-factor test, and the fermentation conditions were optimized by using orthogonal experiment. The results showed that the optimal fermentation medium were as follows: maltose 2%, yeast powder 2%, KH2PO40.15%, MgSO4·7H2O 0.10%, and the optimal fermentation conditions were as follows: fermentation temperature 30℃, inoculation 1%, the initial pH 7.0, the liquid volume 100 mL/ bottle, fermentation time 24 h. Under these conditions, the viable count reached 4.5×1014CFU/mL.

aerobic denitrifier; culture medium; fermentation conditions; optimization

Q815

A

1006-060X（2017）04-0014-05

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.004.004

2017-02-09

湖南省农业委员会2016年湖南重金属污染耕地修复及农作物种植结构调整试点资金专项（湘财农指〔2016〕130号）；湖南省环保科研项目（2015-109）

赵健宇（1992-），男，辽宁鞍山市人，硕士研究生，研究方向为环境生态学。

杨友才