RhoA/Rho激酶信号通路与先天性尿道下裂发生的相关性研究*

余 谨， 赵振宇， 王新光， 刘海浪， 凌 青△

1武汉血液中心，武汉 4300302 华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科，武汉 430030

RhoA/Rho激酶信号通路与先天性尿道下裂发生的相关性研究*

余 谨1， 赵振宇2， 王新光2， 刘海浪2， 凌 青2△

1武汉血液中心，武汉 4300302华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科，武汉 430030

目的 通过构建先天性尿道下裂模型和在体外培养雄性胎鼠尿道海绵体组织来探讨RhoA/Rho激酶信号通路在先天性尿道下裂发生中的作用。方法 通过邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯[di-(2-ethylhexyl)phthalate，DEHP]灌胃法建立先天性尿道下裂大鼠模型，处死大鼠获得尿道海绵体组织后，免疫组化检测RhoA和p-RhoA蛋白表达，荧光定量PCR(qPCR)检测各组大鼠尿道海绵体组织中RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA的表达水平，Western blot检测各组大鼠尿道海绵体组织中RhoA，p-RhoA，MLCP(myosin light chain phosphatase)，p-MLCP，MLC(myosin light chain)，p-MLC蛋白的表达情况。同时对胎鼠的尿道海绵体组织进行体外培养，使用RhoA/Rho激酶通路的抑制剂处理培养中的尿道海绵体组织，观察RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA的表达水平。结果 成功构建了大鼠尿道下裂模型。免疫组化结果显示与对照组相比，先天性尿道下裂大鼠阴茎组织中p-RhoA表达明显增加。qPCR结果显示，先天性尿道下裂大鼠尿道海绵体组织中RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表达水平明显高于对照组(均P<0.05)。Western blot结果显示，先天性尿道下裂大鼠尿道海绵体组织中p-RhoA、p-MLCP、p-MLC蛋白的表达水平较对照组均明显升高(均P<0.05)。体外培养尿道海绵体组织实验发现，RhoA/Rho激酶通路抑制剂可阻碍RhoA/Rho激酶信号通路激活，从而抑制RhoA、ROCK1、ROCK2的表达并减轻DEHP对雄性胎鼠尿道段组织正常发育的抑制作用。结论 RhoA/Rho激酶信号通路激活与先天性尿道下裂的发生有关，抑制RhoA/Rho激酶信号通路激活可降低RhoA、ROCK1和ROCK2表达从而促进尿道海绵体组织正常发育。

RhoA； Rho激酶； 信号通路； 先天性尿道下裂

先天性尿道下裂是一种常见的儿童先天性尿道畸形之一，主要病理改变包括因先天性尿道发育异常而导致的阴茎短小、尿道口异位向阴茎腹侧弯曲、包皮异常等一系列特征[1]。该病多发于新生儿，新生儿发病率高达1/(200～300)到1/51，并呈逐年上升趋势[2-4]，且男性患者多于女性患者[5]。目前研究发现该病与遗传、基因突变、内分泌失调、异常的细胞间信息传递、雄激素受体异常和环境因素等息息相关[6]。手术矫正是目前唯一有效的治疗方法[1]，包括Ⅰ期成形修复手术、阴茎头靠近术、Duckett术式等方式[7]，但是，目前任何一种手术方式均伴有显著的并发症。早期研究已经证实，RhoA/Rho激酶系统在阴茎海绵体及其血管维持平滑肌收缩和张力的生理过程中发挥了重要的作用[8]。

RhoA/Rho激酶信号通路在体内普遍存在，包括3种关键信号分子：Rho激酶、Rho GTP酶和肌球蛋白磷酸酶[9]。小分子Rho GTP酶家族是Ras超家族成员，现已发现的家族主要成员有：RhoA、RhoB、RhoC等，其中最主要的是RhoA[10]。大量的研究发现RhoA/Rho激酶信号系统在多种细胞生理机制中均发挥了介导调节作用,如细胞迁移和增殖、细胞收缩、胞质分裂、基因表达调控、肌动蛋白细胞骨架重建、细胞粘附等[11-12]。研究还发现RhoA/Rho激酶介导的Ca2+敏感性途径能使阴茎海绵体平滑肌及小动脉血管平滑肌处于收缩状态，维持阴茎的疲软状态[13]。本课题旨在比较RhoA/Rho激酶在正常和先天性尿道下裂患儿尿道海绵体组织中的表达，探讨RhoA/Rho激酶信号通路在先天性尿道下裂发生中的作用，为先天性尿道下裂的病因研究提供一定的参考依据，为临床治疗提供指导。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级健康雌性SD大鼠，40只，240～280 g，雄性10只，300～320 g，购于武汉大学实验动物中心。所有SD大鼠饲养环境条件均一，温度24℃，湿度50%，昼夜12 h/12 h，在SPF动物房中饲养。孕期计算以雌雄大鼠1∶1合笼后，每天上午检查有无精液栓，发现精栓时为孕0 d。动物实验部分经本院伦理委员会批准进行。

1.2 动物分组及给药

40只孕12 d的雌性SD大鼠，按照随机数字表，随机分成2组，DEHP[邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯，di-(2-ethylhexyl)phthalate]组和对照组,每组20只。DEHP组行DEHP灌胃处理造模，将DEHP(购于上海化学试剂有限公司)溶于大豆油中每日灌胃，剂量为750 mg/(kg·d)，对照组给予同体积的大豆油每日灌胃，灌胃持续到孕19 d时，从各组中选取10只孕鼠自然分娩，另留取10只用于尿道海绵体体外培养。DEHP组和对照组的孕鼠自然分娩后，对每窝产雄性活仔数进行统计，仔鼠出生后第30天，分别称量体重，判断是否出现尿道下裂的情况，并测量肛门与生殖器的距离(anogenital distance，AGD)。

1.3 组织制备与免疫组化染色

出生后30 d的仔鼠，检查每只雄鼠是否出现尿道下裂，雄鼠麻醉处死，取DEHP组出现尿道下裂的仔雄鼠和对照组仔雄鼠各5只，将尿道海绵体组织用10%甲醛溶液固定24 h，用于组织化学染色剩余仔鼠尿道海绵体组织液氮速冻后置于-80℃中保存备用。

1.4 免疫组化染色

将PBS漂洗过的组织切片3%H2O2封闭15 min，入1%BSA中封闭30 min，漂洗，滴加0.2%BSA稀释的抗RhoA(RhoA)(购于Abcam公司，货号ab54835，稀释比例1∶100)，抗磷酸化RhoA(p-RhoA)(购于Abcam公司，货号ab41435，稀释比例1∶100)，37℃孵育2 h，漂洗，滴加生物素标记的二抗(Abcam公司)37℃孵育2 h，漂洗，滴加DAB复合物，37℃孵育1 h，漂洗，显色，脱水，透明，封片观察。Image Pro Plus 6.0软件分析其平均吸光度值。

1.5 q-PCR检测

分别收集体外培养和仔鼠的尿道海绵体组织，按Trizol(Invitrogen)试剂说明书提取总RNA。采用Bio-Rad产的Spectrophotometer检测RNA溶液A260/A280比值和RNA浓度。A260/A280比值1.8～2.0者用于进一步实验检测。PCR引物由上海生工生物公司合成，引物序列见表1，按照cDNA反转试剂盒(Takara公司)和qPCR试剂盒(天根公司)说明书进行cDNA的反转录和qPCR体系的配制。在荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)中进行反应。PCR反应条件：95℃预变性15 min，95℃，变性10 s，60～66℃退火延伸20～32 s，共40个循环。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法[14]进行RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA的相对定量分析。

表1 qPCR检测引物序列

1.6 Western blot检测

提取生后两组大鼠尿道海绵体组织中的蛋白，按BCA定量试剂盒(武汉博士德公司)的说明书测定蛋白浓度。提取的蛋白加入上样缓冲液后95℃金属浴加热5 min后混匀，每孔上样30 μg，10%聚丙烯酰胺凝胶(武汉博士德公司)电泳分离，电压80 V电泳120 min，转膜电压100 V，PVDF膜湿转，时间70 min，10%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗，其中RhoA(1∶1 000稀释)、p-RhoA、MLCP(myosin light chain phosphatase)、p-MLCP(1∶1 000稀释)购自Abcam公司，MLC(myosin light chain)、p-MLC、β-actin(1∶1 000稀释)购自Santa Cruz公司，4℃过夜。TBST漂洗，3次×5 min，二抗(Abcam公司)室温孵育1 h，洗膜，3次×5 min，化学发光试剂显影。以β-actin为内参。Bio-rad Gel Dol EZ成像仪(GEL DOC EZ IMAGER，Bio-rad，California，USA)显影，目的条带采用Image J软件进行灰度值分析。

1.7 建立雄性胎鼠尿道海绵体体外培养体系

参照Morgan等[15]的方法稍加改进建立雄性胎鼠尿道海绵体体外培养体系，处死19 d孕鼠，无菌条件下取出胎鼠，加双抗的PBS冲洗，解剖胎鼠，以发现睾丸作为确认雄性胎鼠的标志，随后沿根部横切阴茎，将切下的尿道海绵体完整置于0.4 μm微孔滤膜上方，腹侧向下，每孔加入BjGb培养液(购于Gibco公司)1.5 mL，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中进行培养，每24 h更换培养液。将2组雄性胎鼠尿道段再各分为2组，分别按照以下分组给予药物处理：对照不干预组、DEHP不干预组、对照加抑制剂组、DEHP加抑制剂组。两组加抑制剂组均在培养液中加入50 μg/mL的RhoA/Rho激酶信号通路抑制剂Fasudil hydrochloride(购于Abmole公司)处理。培养72 h后，留取样本进行qPCR检测。

1.8 统计学方法

应用SPSS 21.0统计学软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示，统计分析采用单因素方差分析，两两比较采用Bonferroni检验，计数资料组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 出生后雄性仔鼠生殖相关参数和尿道下裂发生率

在自然分娩的大鼠中，DEHP组10只孕鼠共产仔92只，其中雄性43只，尿道下裂仔鼠9只，发生率为20.93%，对照组10只孕鼠共产仔107只，其中雄性57只，未发现尿道下裂仔鼠，DEHP组尿道下裂发生率较对照组明显增加，出生仔鼠体重减轻，且雄性胎鼠的AGD明显减小，差异具有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表2 分娩仔鼠中的生殖相关参数和尿道下裂发生率±s)

AGD：肛门与生殖器的距离；与对照组比较，*P<0.05

2.2 出生后第30天大鼠阴茎组织免疫组化检查

免疫组织化学的检测结果显示，RhoA和p-RhoA蛋白主要在阴茎包皮下、尿道周围的海绵体组织中表达，阳性部位呈棕黄色，RhoA在DEHP组尿道下裂动物尿道海绵体组织中表达略有升高但阳性率计算2组并无差异(P>0.05)，而p-RhoA在DEHP组尿道下裂动物尿道海绵体组织中表达较丰富，在对照组尿道海绵体组织中未见表达，差异有统计学意义(P<0.05)。RhoA通过磷酸化过程，磷酸化为p-RhoA起作用，DEHP组的p-RhoA的阳性表达较对照组明显增加(P<0.05)(图1)。

A：对照组RhoA表达；B：DEHP组RhoA表达；C：对照组p-RhoA表达；D：DEHP组p-RhoA表达；E：两组RhoA免疫组化平均吸光度值结果；F：两组p-RhoA免疫组化平均吸光度结果；与对照组比较，*P<0.05图1 两组动物免疫组化检测RhoA、p-RhoA表达比较Fig.1 Comparison of immunohistochemical results between the two groups

2.3 出生后第30天仔鼠各组尿道海绵体组织RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA的表达水平

对2组动物尿道组织中的mRNA表达情况进行分析，据qPCR结果显示，DEHP组尿道下裂动物尿道组织与正常组动物尿道组织相比，RhoA及下游的ROCK1、ROCK2在转录水平上的表达均有明显升高(均P<0.05)(图2)。

2.4 出生后第30天大鼠各组尿道海绵体组织中蛋白的表达水平

在出生后第30天的大鼠中，每组随机挑选3只，通过Western blot检测两组的尿道组织中RhoA及p-RhoA的表达水平，以及通路下游的MLCP、p-MLCP、MLC、p-MLC蛋白的表达水平。结果表明，与对照组相比，DEHP组尿道下裂动物尿道组织中RhoA、MLCP、MLC的表达均无明显差异(均P>0.05)，而p-RhoA、p-MLCP、p-MLC在DEHP组尿道下裂动物尿道组织中表达明显增高(均P<0.05)(图3)。

2.5 雄性胎鼠尿道段体外培养后各组RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA的表达水平

在体外培养雄性胎鼠尿道段组织后，对4组动物阴茎组织中的mRNA表达情况进行分析，据qPCR结果显示，对照加抑制剂组与对照不干预组相比，RhoA及其下游的ROCK1和ROCK2水平明显降低(均P<0.05)，表达受到抑制，而DEHP不干预组与对照不干预组相比，RhoA及其下游的ROCK1和ROCK2水平明显升高(均P<0.05)，DEHP加抑制剂组与DEHP不干预组相比，RhoA及其下游的ROCK1和ROCK2水平均明显降低(均P<0.05)，且这3种蛋白的mRNA表达水平与对照加抑制剂组相比，略有升高，但差异均无统计学意义(图4)。

与对照组比较，*P<0.05图2 出生后第30天各组大鼠尿道海绵体组织的RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表达水平Fig.2 Expression levels of RhoA，ROCK1 and ROCK2 mRNA in corpus spongiosum tissues of rats at 30 days after birth

与对照组比较，*P<0.05图3 各组尿道组织RhoA、MLCP、MLC及其磷酸化蛋白表达水平Fig.3 The protein expression levels of RhoA,MLCP and MLC in corpus spongiosum tissues in each group

与对照组比较，*P<0.05；与DEHP组比较，#P<0.05图4 雄性胎鼠尿道段体外培养后各组尿道组织的RhoA、ROCK1、ROCK2 mRNA表达水平Fig.4 The expression levels of RhoA，ROCK1 and ROCK2 mRNA in the corpus spongiosum tissues of fetal rats after the in vitro culture of the rat urethral tissues

3 讨论

先天性尿道下裂是小儿常见的先天性生殖器畸形，近年发病率呈上升趋势[16]。手术是解决畸形的主要手段，但由于这是一种较精细的矫型手术，手术难度较大，术后发生并发症的概率较高[17]。因此，找到先天性尿道下裂的标志性物质将为先天性尿道下裂的检测和治疗提供有效的指导。

本研究首先对DEHP和对照组中出生后雄性仔鼠生殖相关参数和尿道下裂的发生率进行比较，发现DEHP组尿道下裂发生率较对照组明显增加，出生仔鼠体重减轻，且雄性胎鼠的AGD明显减小。DEHP是一种邻苯二甲酸酯，它能够诱导过氧化物酶体的增殖并且能调节特异性靶基因的表达[18]。DEHP是一种最常使用的塑化剂，因其对雄性生殖系统的生物毒性而受到广泛关注[19]。有研究证实邻苯二甲酸盐在引起男性生殖道出现诸如尿道下裂等异常中占据非常重要的地位[20]。

本研究发现DEHP组尿道下裂动物尿道海绵体组织与正常组动物相比，与RhoA/Rho激酶信号通路相关的RhoA及下游的ROCK1、ROCK2在转录水平上的表达均有明显升高。Rho激酶是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在静息状态下，Rho激酶的Rho结合结构域和PH结构域、Rho激酶的催化结构域相互作用，抑制激酶的活性[21]。当活化的RhoA与Rho激酶的结合结构域相互作用改变Rho激酶的构型，Rho激酶被激活[22]。RhoA/Rho激酶信号通路激活之后，能够导致MLC的失活，抑制磷酸化的MLC的脱磷酸化反应，进一步增快肌动蛋白微丝骨架聚合的进度，从而调节细胞应力纤维和黏附斑的形成，并且介导细胞一系列的生物学行为以及功能，包括粘附、迁移、增殖以及收缩等[23]。ROCK是Rho分子下游靶效应分子，其包含2种同源异构体：ROCK1和ROCK2[24]。文献表明，RhoA/Rho激酶所介导的Ca2+敏感性通路可导致阴茎海绵体平滑肌和小动脉血管平滑肌收缩，由此维持阴茎疲软状态[25]。并且，有关动物模型以及关于人阴茎的研究结果均证实RhoA/Rho激酶蛋白在阴茎海绵体组织内有表达，这说明RhoA/Rho激酶蛋白参与了阴茎海绵体组织的活动，而尿道是与阴茎紧密相连的，这一发现表明RhoA/Rho激酶有可能也是尿道下裂的重要机制之一[26]。

综上所述，本研究表明RhoA/Rho激酶信号通路激活与先天性尿道下裂的发生有关，抑制RhoA/Rho激酶信号通路激活可降低RhoA、ROCK1和ROCK2表达从而促进尿道海绵体组织正常发育。由于对先天性尿道下裂中RhoA/Rho激酶信号通路的研究甚少，还有许多关键问题亟待解决，深入研究RhoA参与尿道形成过程中细胞信号转导机制，将为发现先天性尿道下裂的治疗及预后评估的新靶点提供理论依据。

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(2016-11-29 收稿)

Association of the RhoA/Rho Kinase Signaling Pathway with Congenital Hypospadias

Yu Jin1，Zhao Zhenyu2，Wang Xinguang2etal

1WuhanBloodCenter，Wuhan430030，China2DepartmentofUrology，TongjiHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China

Objective To construct the model of congenital hypospadias and to explore the mechanism of the RhoA/Rho kinase signal pathway in congenital hypospadias in fetal ratsinvitro.Methods Rats were administered di-(2-ethylhexyl)-phthalate(DEHP)by gavage to establish the model of congenital hypospadias.Immunohistochemistry was performed in rat corpus spongiosum tissues.The expression levels of RhoA，ROCK1，and ROCK2 mRNA were detected by fluorescence quantitative PCR(qPCR)，and those of RhoA，p-RhoA，myosin light chain phosphatase(MLCP)，p-MLCP，myosin light chain(MLC)，and p-MLC protein by Western blotting.At the same time，the corpus spongiosum tissues of fetal rats were culturedinvitro.After treatment of the corpus spongiosum tissues with the inhibitor of the RhoA/Rho kinase pathway，the expression levels of RhoA，ROCK1，and ROCK2 mRNA were measured.Results The rat model of hypospadias was successfully constructed.Immunohistochemistry showed that the expression level of p-RhoA was significantly increased in the model group as compared with that in the control group.qPCR results showed that the expression levels of RhoA，ROCK1，and ROCK2 mRNA were significantly higher in the congenital hypospadias rats than in the control rats(P<0.05).Western blotting showed that the expression levels of p-RhoA，p-MLCP，and p-MLC protein were significantly higher in the congenital hypospadias rats than in the control rats(P<0.05).RhoA/Rho kinase pathway inhibitors could inhibit the activation of the RhoA/Rho kinase signaling pathway，therefore suppressing the expression levels of the RhoA，ROCK1，and ROCK2 and reducing the inhibitory effect of DEHP on the normal development of corpus spongiosum tissues of male fetal rats.Conclusion The activation of the RhoA/Rho kinase signal pathway is associated with the development of congenital hypospadias.Inhibition of the RhoA/Rho kinase signaling pathway can reduce the expression levels of RhoA，ROCK1 and ROCK2 and thereby promote the normal development of corpus spongiosum tissues.

RhoA； Rho kinase； signal pathway； congenital hypospadias

*武汉市卫生计生委科研项目(No.WX15D61)；中央高校基本科研业务费资助项目(No.HUST-0118540269)

R695.3

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.02.004

余 谨，女，1986年生，医学博士，E-mail：435387513@qq.com

△通讯作者，Corresponding author，E-mail：lingqing1985@163.com