基于CNPs的荧光DNA生物传感器对EV71的检测分析

迟 旭，盛传伦*，王锦鸿

(1.吉林大学中日联谊医院 感染科，吉林 长春130033；2.南方医科大学第三附属医院 呼吸科，广东 广州510000)

基于CNPs的荧光DNA生物传感器对EV71的检测分析

迟 旭1，盛传伦1*，王锦鸿2*

(1.吉林大学中日联谊医院 感染科，吉林 长春130033；2.南方医科大学第三附属医院 呼吸科，广东 广州510000)

DNA生物传感器是一种基于DNA碱基互补配对原则的高灵敏度、高特异性的DNA检测方法，它通过检测探针DNA与靶向DNA杂交引起的可检测信号的改变，从而实现对靶向DNA的检测[1,2]。目前，已报道了多种基于不同检测信号的DNA生物传感器[3]，包括电化学生物传感器、压电生物传感器[4]和DNA荧光传感器等。其中，荧光DNA传感器[5]因具有检测灵敏度高，操作简单，抗干扰能力强等优点，是目前研究最为广泛的DNA生物传感器。

碳纳米粒子(carbon nanoparticles，CNPs)为一种纳米材料，可作为一种荧光淬灭剂，具有淬灭不同发射频率的荧光基团的能力[6]。用纳米材料作为荧光淬灭剂，就不用考虑荧光发射基团和淬灭基团的匹配选择性。这种方法检测的原理是：由于这些结构富含π共轭结构，这样就会靠π-π堆积作用吸附含有自由碱基的单链DNA (single-stranded DNA，ssDNA)探针，同时与标记的荧光基团发生电子转移而淬灭它的荧光，当目标DNA出现的时候，由于与探针的杂交形成的双链DNA不再有可利用的自由碱基，这样就会从纳米材料上解吸附，荧光信号也会相应地增强，从而实现检测。因此，现就基于CNPs的DNA荧光传感器对手足口病毒EV71 DNA检测的可行性及灵敏性进行分析。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 本实验所有核酸由生工生物工程(上海)股份有限公司及宝生物工程(大连)有限公司合成；所用核酸序列为PEV71(与手足口病毒EV71有关的修饰有羧基荧光素FAM荧光基团的单链DNA探针)：5’-FAM-AGT CAG TGT GGA AAA TCT CTA GC-3’；T1(与PEV71完全互补的目标DNA)：5’-GCT AGA GAT TTT CCA CAC TGA CT-3’；T2(与PEV71互补且存在一个碱基错配的目标DNA)：5’-GCT AGA GAT TGT CCA CAC TGA CT-3’；T3(与PEV71完全不互补的目标DNA)：5’-TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TT-3’。铟锡氧化物导电玻璃(ITO)购自中国深圳南玻公司；实验所用水均为Millipore Milli-Q 纯化过的超纯水(电阻率大于18MΩ)。

1.2 主要仪器 本实验所用仪器为扫描电子显微镜(XL30 ESEM FEG扫描电镜加速电压20 kV)；能量分散X射线光谱仪(EDX)；透射电子显微镜(HITACHIH-8100 EM加速电压为200 kV)；Cary 500 Scan UV-Vis-NIR光谱仪(Varian，Harbor City，CA，USA)；Zeta PALS，ξ-电势分析仪(Brookhaven Co.)；荧光光谱用PerkinElmer LS55荧谱仪(PerkinElmer Instruments，UK)；RF-5301PC荧光光谱仪(Shimadzu，Japan)。

1.3 CNPs制备[7]将干净的烧杯倒扣于蜡烛火焰上收集蜡烛灰，将3 mg收集到的蜡烛灰超生分散于12 ml水/乙醇(1∶1)中。然后在3 000 rpm转速下离心2 min 去除较大的蜡烛灰颗粒，然后将悬浮液在6 000 rpm转速下离心2 min，收集黑色沉淀物，将其分散于12 ml水/乙醇(1∶1)中备后用。应用电镜对制备的CNPs进行低倍率及高倍率的扫描。

1.4 样品制备 在形貌表征前，电沉积后的导电氧化铟锡(Indium tin oxide，ITO)玻璃经过二次水以及乙醇冲洗以去掉物理吸附的支持电解质，然后用氮气吹干。样品的制备通常是将2 μl样品的悬浮液滴于ITO表面，然后自然干燥。DNA粉末经离心、水溶后，用Cary 500 Scan UV-Vis-NIR光谱仪测其在260 nm 波长下的吸光度来定量。ξ-电势的测量在ξ-电势分析仪上完成。用于荧光测定的每个样品的体积均为400 μl。

1.5 EV71病毒DNA序列的检测 ①分别在有/无CNPs的情况下用PEV71(50 nM)对EV71病毒DNA序列T1(30 nM和300 nM)进行检测，并同时检测PEV71、CNPs和PEV71+CNPs。激发波长为480 nm，记录荧光发射光谱及在525 nm波长下的荧光强度。②应用PEV71+CNPs体系，对与PEV71完全互补的目标序列T1(300 nM)、与PEV71互补且存在单碱基错配的目标序列T2(300 nM)以及与PEV71完全不互补的目标序列T3(300 nM)分别进行检测，并记录其荧光发射光谱。③在CNPs浓度分别为0，7，13，20，27，33，40 μl的情况下，应用PEV71+CNPs体系对T1进行检测，并记录PEV71+CNPs和PEV71+CNPs+T1的荧光强度。

2 结果

2.1 CNPs的表征 图1中a和b分别是制备的CNPs的低倍率、高倍率的扫描电镜照片，从低倍率的扫描电镜照片可以看出大量的纳米颗粒，高倍率的扫描电镜照片进一步显示他们的形状近乎球形，颗粒直径达25-40 nm之间。这也可由其透射电镜照片证实(图1c)。

图1 CNPs的扫描电镜照片以及透射电镜照片

2.2 可行性分析 为了验证CNPs作为检测平台对EV71病毒DNA检测的可行性，我们选择了一段EV71病毒的DNA序列来进行实验。图2显示了PEV71在不同条件下的荧光发射光谱。在没有CNPs的情况下，PEV71由于存在未淬灭的FAM荧光基团而发射出强的荧光(曲线a)。然而，当有CNPs出现的时候，荧光强度淬灭了82%(曲线c)。当与T1混合40 min后，PEV71+CNPs体系的荧光得到强烈的增强，恢复80%的荧光(曲线d)。需要指出的是，在没有CNPs的情况下自由的PEV71的荧光受T1的影响很小(曲线b)。同样需要注意的是，由于CNPs本身的弱的荧光(曲线e)会对检测整体的荧光造成影响，因此，所有在CNPs存在的情况下检测的荧光都要扣除背景。图2显示了PEV71+CNPs体系的荧光变化程度(F/F0-1)随不同浓度目标的荧光强度化的情况，F和F0分别是该体系有/无T1时在525 nm波长下的荧光强度。在当T1浓度从30 nM增加到300 nM时，FAM荧光强度急剧增强。

2.3 灵敏性分析 通过检测PEV71+CNPs与T1、T2以及T3反映的荧光强度反映此检测平台的灵敏性。如图3所示，PEV71+CNPs在300 nM T2条件(曲线c)下，其荧光强度F/F0的比值大约在300 nM T1条件(曲线b)下的80%。而PEV71+CNPs不与T3(曲线d)反应，其所产生的荧光与空白(曲线a)相差无几。

2.4 CNPs的不同浓度对检测的影响 PEV71+CNPs体系中CNPs的浓度对荧光淬灭和恢复都有一定的影响。图4显示了PEV71+CNPs体系中不同CNPs浓度下荧光淬灭和恢复的情况，其中CNPs的浓度依次为0，7，13，20，27，33，40 μl。可见，CNPs浓度与淬灭程度呈正相关性。然而当CNPs浓度过高时，部分目标序列DNA也会被吸附至CNPs的空白区域上，不与单链DNA探针杂交，致使杂交效率和体系荧光恢复程度降低。

3 讨论

目前可知人类有超过4000种疾病与DNA有关，因此通过对DNA检测可以实现对疾病的早期诊断。此外，DNA检测可以实现对病毒和细菌的种类、亚型诊断，因而对传染病的治疗具有重要的指导意义。DNA生物传感器是一种基于DNA碱基互补配对原则的高灵敏度、高特异性的DNA检测方法，它通过检测探针DNA与靶向DNA杂交引起的信号改变，从而实现对靶向DNA的检测。而随着各种各样纳米材料的出现，探索它们在生物技术中以医学诊断为目的的应用得到了广泛的研究[8,9]。常见的纳米材料主要包括：单壁碳纳米管(Single-walled nanotubes，SWNTs)、多壁碳纳米管(Multi-walled nanotubes，MWNTs)、石墨烯(Graphene)以及纳米碳球(Carbon nanoparticles)等。近年来，纳米材料在建立DNA生物传感器中的作用亦受到关注。上海物理所的樊春海[10]小组开发出了一种应用石墨烯为荧光基团淬灭剂的荧光增强多元DNA生物传感器，通过石墨烯表面吸附的三种不同荧光探针实现三元DNA的同时检测。

图2 PEV71(50 nM)在不同条件下的荧光发射光谱 图3 PEV71(50 nM)在不同条件下CNPs荧光淬灭和 图4 在不同用量CNPs的情况下PEV71+PEV71+CNPs+T1荧光恢复的荧光强度

本研究所用的CNPs检测体系对病毒DNA进行检测的原理主要分为两步：(1)由于单链核酸探针未配对碱基与富含π键的CNPs发生π-π堆积而把单链探针DNA吸附到表面，同时由于与探针标记的荧光基团发生电子转移而引起荧光的淬灭。(2)在有目标DNA序列出现的情况下，由于与探针DNA杂交后形成双链DNA中未配对碱基的消失，CNPs对双链DNA吸附减弱，探针与目标DNA形成的双链从CNPs表面脱离，同时恢复标记的荧光基团的荧光，从而利用增强的荧光来实现目标DNA序列的检测。

我们根据Sun等[7]报道的从蜡烛灰中分离得到CNPs，并证实了能够建立基于CNPs的DNA荧光生物传感器，CNPs/DNA体系可有效地应用荧光检测DNA，也有望用作监测其他生物分子之间相互作用的探针。CNPs能够吸附单链DNA并具备强淬灭荧光基团的能力，当PEV71吸附于CNPs上时，荧光强度明显降低。而这种吸附并不影响探针PEV71与目标序列的杂交，当PEV71+CNPs与T1混合后，荧光得到恢复，目标序列的检测浓度可达30 nM至300 nM，随目标序列浓度升高，荧光强度也急剧升高。同时该体系具有很高的灵敏性和重复性，可区分单碱基错配。同时，本研究也就CNPs的浓度变化对DNA检测的影响进行了初步研究。CNPs浓度虽与猝灭程度呈正相关，但其浓度过高可造成杂交效率和荧光恢复程度的降低，故此我们推荐选择20 μl CNPs用于DNA检测。

本研究以纳米材料为检测平台利用荧光方法实现对生物分子的检测，建立了一种灵敏且具选择性的DNA传感器，实现了对DNA的灵敏检测，为DNA检测精细化、便捷化提供了理论及实验依据。

[1]张 泽，万广财，王 娜，等.电化学DNA生物传感器的指示方法及其临床研究进展[J].医学综述，2015，(22)：4036.

[2]Zhu Y,Chandra P,Song KM,et al.Label-free detection of kanamycin based on the aptamer-functionalized conducting polymer/gold nanocomposite[J].Biosensors & bioelectronics,2012,36(1):29.

[3]黄智伟，黄 琛.DNA生物传感器的进展[J].传感器技术，2001，(01)：4.

[4]Xiao Y,Rowe AA,Plaxco KW.Electrochemical detection of parts-per-billion lead via an electrode-bound DNAzyme assembly[J].Journal of the American Chemical Society,2007,129(2):262.

[5]Zhao C,Wu L,Ren J,et al.A label-free fluorescent turn-on enzymatic amplification assay for DNA detection using ligand-responsive G-quadruplex formation[J].Chem Commun (Camb),2011,47(19):5461.

[6]王利勇，贾红霞，成永强，等.水溶性碳纳米粒子的制备及其在DNA和单核苷酸多态性分析中的应用[J].中国科学：化学，2011，(09)：1515.

[7]Li H,Zhang Y,Wang L,et al.Nucleic acid detection using carbon nanoparticles as a fluorescent sensing platform[J].Chem Commun (Camb),2011,47(3):961.

[8]Chen H,Wang J,Liang G,et al.A novel exonuclease III aided amplification method for sensitive nucleic acid detection based on single walled carbon nanotube induced quenching[J].Chem Commun (Camb),2012,48(2):269.

[9]Li R,Wu D,Li H,et al.Label-free amperometric immunosensor for the detection of human serum chorionic gonadotropin based on nanoporous gold and graphene[J].Analytical biochemistry,2011,414(2):196.

[10]李 静，裴 昊，李 凡，等.基于氧化石墨烯淬灭效应的DNA传感器特异性检测三聚氰胺[J].核技术，2012，(05)：386.

吉林省社会发展领域重点科技支撑项目(2011456)

1007-4287(2017)04-0702-03

2016-07-22)

*通讯作者