内质网应激诱导剂Salubrinal在大鼠急性肺损伤的作用机制的研究

张海涛,饶艳伟*,贾桂风

(1.吉林省人民医院 重症医学科,吉林 长春130021； 2.吉林大学第一医院 妇产科)

内质网应激诱导剂Salubrinal在大鼠急性肺损伤的作用机制的研究

张海涛1,饶艳伟1*,贾桂风2

(1.吉林省人民医院 重症医学科,吉林 长春130021； 2.吉林大学第一医院 妇产科)

急性肺损伤是有各种诱因(严重感染、脓毒症、外伤、休克、有害气体吸入等)导致的急性以及进行性的缺氧性呼吸衰竭。其临床表现为起病急，常规吸氧后低氧血症难以纠正，双肺可闻及湿啰音等。目前临床上主要以对症治疗、呼吸支持和液体疗法为主[1]。但是也有通过糖皮质激素、前列腺素E1、环氧化酶抑制剂进行治疗。Salubrinal为选择性抑制elF2a去磷酸化的抑制剂，是在大鼠嗜铬细胞瘤发生内质网应激而引起的凋亡中的化合物筛选出的小分子化合物，进一步研究发现其可以选择性诱导elF2a磷酸化和抑制去磷酸化作用，最终可以保护细胞避免内质网应激相关的凋亡。Boyce M的研究认为Salubrinal引起细胞中GRP78表达增高，认为Salubrinal可能上调GRP78来避免细胞中的内质网应激相关凋亡的发生[2,3]。本研究以急性肺损伤大鼠为研究对象，通过观察大鼠血清中谷胱甘肽的水平和肺组织中Nrf2蛋白的表达，阐明选择性磷酸酶抑制剂Salubrinal在急性肺损伤大鼠肺损伤中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品及主要试剂

脂多糖(美国 Sigma 公司)，Salubrinal (Sal，美国 Sigma 公司)，Nrf2蛋白抗体(美国 Santa Cruz 公司)，3，3'-二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、谷胱甘肽试剂盒(福州迈新生物制品公司)。

1.2 实验动物及分组

健康Wistar大鼠48只，雌雄各半，体质量(250±10)g，由吉林大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK-(吉)2008-0005。将大鼠随机分为对照组、 急性肺损伤组、 急性肺损伤 Sal 1.0治疗组，每组16只。

1.3 动物模型制备及处理

① 对照组：一次性灌胃1 mL生理盐水；每日2次腹腔注射1 mL生理盐水。② 急性肺损组(ALI)：一次性给予5 mg/kg 脂多糖静脉注射。③ Sal 1.0治疗组，一次性给予5 mg/kg 脂多糖静脉注射造模后，腹腔注射1.0 mg/kg/天 Salubrinal。本实验动物处置方法符合动物伦理学标准。

1.4 检测指标及方法

造模7 d后腹腔注射10%水合氯醛麻醉，留取肝素化的大鼠尾静脉血。取肺组织-80 ℃保存。同时右肺中叶应用10%中性甲醛溶液予以固定48 h，之后进行脱水、浸蜡、包埋、切片等过程，最后给予苏木素-伊红(HE)染色。冷冻肺组织行蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)。

1.4.1 肺组织形态学观察 取肺组织切片，经脱蜡、HE染色、梯度乙醇脱水、透明、封固光镜下观察。

1.4.2 Western Blot检测肺组织Nrf2蛋白表达 提取肺组织总蛋白，Bio-Rad 法测定蛋白含量，然后按BCA蛋白定量试剂盒说明书步骤操作，测定Nrf2样品的蛋白浓度。用Image J图像处理软件计算各条带灰度值，分析Nrf2蛋白的表达情况。以目的蛋白与内参照β-肌动蛋白(β-actin)的灰度值比值表示。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 肺组织形态学观察

急性肺损伤组大鼠肺组织部分损伤，出现了大量的炎症及局部肺组织出血明显，镜下观察有塌陷的肺泡壁，肺泡腔扩大，肺泡隔显著增厚；而Sal 治疗组肺组织病理改变较急性肺损伤组明显减轻(图1)。

图1 急性肺损伤大鼠肺组织HE染色(×40)

2.2 Western Blot检测Nrf2蛋白表达

与对照组相比，急性肺损伤组Nrf2蛋白表达显著降低(P<0.05)；与急性肺损伤组相比，Sal组Nrf2蛋白表明显达增高，差异有显著的统计学意义(P<0.01)，见图2。

图2 急性肺损伤大鼠的肺组织中Nrf 2蛋白的表达

2.3 血清学检测发现

急性肺损伤大鼠Sal 治疗组的血清中GSH/GSSG值(3.71±0.06)与急性肺损伤组(1.98±0.16)相比明显增高(P<0.05)。

3 讨论

急性肺损伤是有各种诱因导致的急性以及进行性的缺氧性呼吸衰竭。其临床表现为起病急，常规吸氧后低氧血症难以纠正，双肺可闻及湿罗音等。研究发现其病死率仍然较高，依照1994年颁布的ALI/ARDS的诊断标准后，不同国家和地区的统计显示其病死率仍然为30%-40%[4]。但是在中国上海的统计住院病死率68.5%[5]，北京地区住院病死率为52.0%[6]。所以，急性肺损伤的病死率在我国总体水平仍然很高，需要进行相关的药物创新。本实验通过应用选择性磷酸酶抑制剂Salubrinal对急性肺损伤大鼠进行干预观察，为临床治疗提供一个新的方向。

Salubrinal为选择性抑制elF2a去磷酸化的抑制剂，是在大鼠嗜铬细胞瘤发生内质网应激而引起的凋亡中的化合物筛选出的小分子化合物，进一步研究发现其可以选择性诱导elF2a磷酸化和抑制去磷酸化作用，最终可以保护细胞避免内质网应激相关的凋亡。Boyce M.的研究认为Salubrinal引起细胞中GRP78表达增高，认为Salubrinal可能上调GRP78来避免细胞中的内质网应激相关凋亡的发生[2,3]。本研究中，我们发现通过给予Salubrinal处理急性肺损伤大鼠后，发现大鼠肺组织形态有明显的改变。其中在孙明莉等[7]在百草枯中毒大鼠经过Salubrinal处理后，发现Salubrinal也能明显改变其肺组织的形态。同时我们也检测了血清中的还原型谷胱甘肽的水平，发现与急性肺损伤组相比，Sal治疗组的还原型谷胱甘肽的水平明显增高。这说明Salubrinal能提高大鼠血清中的抗氧化水平，对体内产生保护性作用。进一步的研究我们检测了大鼠肺组织的Nrf2蛋白表达，研究发现与急性肺损伤组相比，Sal治疗组的Nrf2蛋白表达明显增高。其中研究发现在正常的细胞中 Nrf2蛋白水平表达很低，当细胞在外界刺激后处于应激的状态时，细胞中的Nrf2调节因子 Keap1在半胱氨酸残基直接修饰作用后，改变了对 核内Nrf2 调节作用，保持了Nrf2稳定性，之后进入细胞核内激活抗氧化酶以及解毒基因的表达。保证Nrf2 蛋白的稳定性对于应激状态下Nrf2途径的激活起到了主要的作用[8]。因此，在细胞处于应激的条件下，Keap1-Nrf2 途径通过一种去抑制作用促使 Nrf2 从 Keap1 的抑制作用中解放出来发挥抗氧化应激作用，进而提高细胞的抗氧化水平。所以，在本研究中我们认为Salubrinal可能是通过活化 Keap1-Nrf2 途径，降低急性肺损伤大鼠的ROS水平，提高了其抗氧化水平起到保护性作用，有可能为临床的急性肺损伤的患者提供一种新的治疗策略。

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吉林省卫生计生委资助(2015SZC13)

1007-4287(2017)04-0696-03

2016-06-11)

*通讯作者