内源性一氧化碳对心肌缺血再灌注损伤的影响*

周 振，张 昱，纪巧荣，刘 杰，曹成珠，高 翔，张 伟

(青海大学高原医学研究中心；青海省高原医学应用基础重点实验室，青海 西宁 810001)

内源性一氧化碳对心肌缺血再灌注损伤的影响*

周 振，张 昱，纪巧荣，刘 杰，曹成珠，高 翔，张 伟△

(青海大学高原医学研究中心；青海省高原医学应用基础重点实验室，青海 西宁 810001)

目的 研究内源性一氧化碳对大鼠离体心脏心肌缺血再灌注损伤的影响。方法 大鼠经内源性一氧化碳激动药物原卟啉氯化钴(CoPP)处理后，采用Langendorff离体心脏灌流系统制作心肌缺血再灌注实验模型，采集记录离体心脏稳定期和缺血30 min再灌注时的左室收缩终末压(LVESP)、左心室舒张终末压(LVEDP)、心率(HR)、左室发展压(LVDP)、左室最大收缩速率(+dP/dtmax)和左室最大舒张速率(-dP/dtmax)等心功能指标，探讨内源性一氧化碳对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响。结果 在停灌前稳定期，对照组和药物组心脏各项指标均保持平稳，两组间指标无显著性差异；停灌30 min后复灌，对照组较未停灌前心功能各项指标明显下降，且变化较大，对心脏的舒缩功能影响较大，该组比停灌前LVESP下降了19.8%，+dP/dtmax下降了28.5%，-dP/dtmax的绝对值下降了33.6%，差异均具有显著性(P<0.05)。而药物组复灌后各项心功能指标变化较小，仍保持着停灌前的平稳水平，对心脏的舒缩功能影响较小，且复灌后达到稳定所用的时间较对照组明显缩短(P<0.05)。结论 内源性一氧化碳对正常情况下心室的舒缩功能影响不大，但对心肌缺血再灌注损伤具有一定的保护作用。

内源性一氧化碳 缺血再灌注损伤 Langendoreff心脏离体灌流 心脏舒缩功能

一氧化碳(Carbon Monoxide，CO)被认为是一种能高度结合血红蛋白从而使机体严重缺氧的高毒性物质[1]，然而近些年的研究发现，一氧化碳在体内又是一种重要的内源性气体分子，调节着众多生理和病理生理过程，并且在心血管系统、免疫系统以及中枢神经系统等许多系统中起着重要的作用。[2-3]体内的一氧化碳是血红素氧合酶(Heme Oxygenase，HO)分解血红素得到的产物，已经有许多研究发现血红素通过血红素氧和酶分解之后能产生许多对机体有益的物质[4]，内源性一氧化碳(Endogenous Carbon Monoxide)就是其中之一，其对于机体具有的保护作用也已被证实[5]，但对心肌发生的缺血再灌注损伤是否具有保护作用尚未证实。本研究利用Langendorff离体心脏灌流系统观察内源性一氧化碳激动剂CoPP干预下心肌缺血再灌注损伤模型的各项心功能指标，探讨内源性一氧化碳对心肌缺血再灌注损伤的影响，为心肌的缺血性保护提供有效依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用SPF级Wistar雄性成年大鼠，购于北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK(京)2012-0001，NO.11400700064575]。每组9只，体重251±9.4 g，大鼠置于23 ℃、昼/夜交替、自由采水和食物的条件下饲养。

1.2 实验药品和试剂

实验用K-H液配制如下，NaCl 6.966 g/L，KCl 0.3653 g/L，CaCl20.2725 g/L，KH2PO40.1633 g/L，MgSO4·7H2O 0.2958 g/L，NaHCO32.1003 g/L，葡萄糖2.199 g/L，调节pH于7.3～7.4之间，药品均购自Sigma公司，由超纯水配制而成。麻醉剂选用乌拉坦(国药集团化学试剂有限公司，批号T20090811)，用生理盐水配制成20%的溶液，即配即用(0.08ml/100g)。原卟啉氯化钴(CoPP)购自Sigma公司(C1900，MW：655.03)，用1N NaOH溶液溶解后稀盐酸调至pH 7.4，再用生理盐水稀释到目标体积。

1.3 实验仪器

选用澳大利亚AD公司Langendorff心脏灌流系统(AD Instrument，Australia)，包括Powerlab数据采集系统、压力传感器、蠕动泵、聚乙烯导管及乳胶球囊等全套装备。

1.4 Langendorff离体心脏灌流模型

药物组大鼠在实验进行前24 h腹腔注射内源性一氧化碳的激动剂CoPP(5mg/kg)[6]，24 h后腹腔注射20%乌拉坦(40mg/kg，i.p)，开胸取出心脏，置于4 ℃ K-H液中，分离出升主动脉后清除干净心脏内残留血液，将灌注针固定到升主动脉后迅速悬挂固定于Langendorff离体灌注装置上，持续通入95% O2和5% CO2混合气体的K-H液行常规恒压(40～60mmHg)灌流。剪开左心耳，将连接有压力传感器的心室球囊通过左心耳置入左心室，并将球囊内压力维持在5～9 mmHg[7]，连接Powerlab信号采集器，采集记录离体心脏左室收缩终末压(1eft ventricularend-systolic pressure，LVESP)、左心室舒张终末压(1eft ventricularend-diastolic pressure，LVEDP)、心率(heart rate，HR)、左室发展压(1eft ventricular developed pressure，LVDP)、左室最大收缩速率(+dP/dtmax)和左室最大舒张速率(-dP/dtmax)[8]。

对照组取心脏前不做处理，麻醉后进行离体心脏灌注，步骤同上。

1.5 离体心脏缺血再灌注损伤模型

待心脏搏动稳定后记录停灌前稳定期30 min各项数据，停止灌流30 min即刻复灌，待心脏恢复跳动记录30 min的复灌后各项指标[9]。

1.6 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件，所有数据以均数±标准差表示，组间比较用t检验，组内不同时间点比较选用LSD法，灌注前后比较选用配对t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 离体心脏各时期心室生理学指标的变化情况(图1～3，表1～3)

图1 缺血再灌注时心室各生理学指标的变化描记图
Figure 1 The representative recordings of the ventricular function index in ischemic reperfusion

图2 停灌前各生理学指标的变化趋势图Figure 2 The summary of the changes in mean cardiac function index before ischemic reperfusion

图3 复灌后各生理学指标的变化趋势图Figure 3 The summary of the changes in mean cardiac function index after ischemic reperfusion

表1 停灌前不同时间段各生理学指标的变化情况±s)Table 1 The changes in mean cardiac function index fromdifferenttimesbefore ischemic ±s)

续表：

表2 复灌后不同时间段各生理学指标的变化情况±s)Table 2 the changes in mean cardiac function index fromdifferenttimesafterischemic ±s)

*：表示与对照组比较，P<0.05；#：表示与起始点比较，P<0.05.

图1～2和表1显示，停灌前稳定期对照组和药物组心脏LVESP、LVEDP、LVDP、左室±dP/dtmax变化趋势一致，每一时间段之间差异不显著，HR和FP始终保持稳定。

图1、3和表2显示，缺血再灌注后，对照组心脏各舒缩指标明显下降，和停灌前相比LVESP下降了19.8%，+dP/dtmax下降了28.5%，-dP/dtmax的绝对值下降了33.6%，均有显著性差异(P<0.05)，但随时间的变化舒缩指标也呈现缓慢上升的趋势，10 min后的上述指标较复灌起始点出现明显差异(P<0.05)，HR波动较大，尤其在15 min后，差异显著(P<0.05)，FP始终保持稳定、变化不明显。与对照组相比，药物组各项心脏指标在缺血再灌注前后相对平稳，能保持不变，尤其在缺血再灌注后心脏能保持较稳定的搏动状态。

2.2 心脏生理学指标变化结果(表3)

表3 心脏在灌注前后各生理学指标的变化情况±s)Table 3 Changes in cardiac perfusion and reperfusion process in various physiological ±s)

▲：表示与对照组比较，P<0.05.

表3显示，对照组停灌前后各项心脏功能指标均具有显著差异(P<0.05)，而药物组停灌前后各项指标没有显著性差异。与对照组相比，药物组在停灌前后HR均较低，其他指标没有显著性差异；由于药物组在缺血再灌注后各项心功能指标未出现明显改变，所以与对照组相比，除FP外其他指标均有显著性差异(P<0.05)；缺血再灌注后，对照组灌注压明显上升，说明缺血再灌注影响了对照组心脏的顺应性。

2.3 复灌恢复稳定时间

在缺血再灌注损伤发生后，心肌或多或少地出现了功能上的障碍，而复灌后恢复稳定所需要的时间是衡量心脏受损的一个重要指标。与对照组相比，药物组复灌恢复稳定时间为4.2±1.0 min，比对照组的8.1±1.4 min明显缩短，差异有显著性(t=4.26，P<0.05)，药物组在复灌时能更快的进入稳定期。

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤是冠心病、溶栓治疗，器官再植等疾病治疗中常见的临床现象，但是缺少有效治疗和预防手段。内源性一氧化碳作为一种重要的气体信号分子，可通过血红素氧和酶-1产生，同时内源性一氧化碳还能减少细胞Ca2+内流，并且具有抗氧化活性[10]。故研究内源性一氧化碳和血红素代谢产物是否对心肌缺血再灌注损伤起到保护作用具有重要的意义，也可为今后心肌缺血再灌注损伤的治疗提供切实、有效的理论依据。

本实验采用Langendorff离体心脏灌流系统建立心肌缺血再灌注模型，讨论内源性一氧化碳对心肌缺血再灌注损伤的影响。其中，离体心脏灌流能使心脏脱离体内神经及体液因素的干扰，一方面能单纯地反映药物对心肌舒缩的直接影响，另一方面还能较好地反映心脏在受到缺血再灌注损伤后各个时段舒缩功能的变化[11]。因此，Langendorff灌流装置能够较好体现内源性一氧化碳对心肌缺血再灌注前后心脏舒缩功能的影响与调节作用，并且通过左心室放置的球囊能同步检测心脏各项指标的变化情况。LVESP、±dP/dtmax、LVDP等是反映Langendorff离体心脏左心室舒缩功能的主要指标，这四项指标的数值高低反映了左心室的舒缩功能强弱，在发生心肌缺血再灌注之后，上述心功能指标的变化说明了心室舒缩功能受影响的高低[12]。

通过本次实验结果可以看出，对照组和药物组在缺血再灌注前稳定期的主要心脏功能指标没有大的差异，说明内源性一氧化碳对正常情况下心室的舒缩功能影响较小，而在缺血再灌注后两组之间的心脏舒缩功能发生了明显的差异，对照组LVESP、±dP/dtmax和LVDP等心功能指标均下降，而药物组仍然保持了停灌前的平稳水平，这说明内源性一氧化碳能维持稳定停灌后心脏舒缩功能，其对心肌的缺血再灌注损伤具有一定的保护作用。与此同时，对照组的FP在复灌后高于停灌注前的水平，这可能是由于心肌缺血再灌注损伤发生后影响了心脏内的微循环和组织结构，使得心脏的顺应性降低、僵硬度增加，其FP升高势必会影响心室的舒缩功能。另外，在复灌的最初阶段，药物组复灌稳定所需要的时间明显低于对照组，这也可说明内源性的一氧化碳能保护停灌后处于缺血、缺氧的心肌组织，能较好地维持心脏的微循环和组织细胞，改善心脏的组织结构和顺应性，表现出复灌后心脏舒缩功能的快速恢复和FP的稳定。

本研究应用了内源性一氧化碳激动剂CoPP，这种药物可以促进HO-1分解血红素产生一氧化碳，从而使得体内内源性一氧化碳含量增加，尤其是在肝脏和心脏[13]等血液供应充足的器官。通过实验结果可以看出，使用内源性一氧化碳激动剂的大鼠离体心脏舒缩功能均可保持在一个相对稳定的状态，即使发生缺血再灌注损伤后仍保持了停灌前的稳定状态，无论是停灌前还是复灌后，药物组心脏的舒缩功能指标始终保持在一个较平稳的水平，这可能与内源性一氧化碳能降低心肌细胞Ca2+内流、减少钙超载等作用[14]有关。另外，药物组停灌前后的HR虽保持平稳，但始终低于对照组，这也可能是因为内源性一氧化碳可通过心肌细胞内Ca2+的减少[15]使心室舒张延缓；而对照组在复灌后心率升高，这说明心肌在发生缺血再灌注损伤后出现了心肌细胞的钙超载。心肌细胞短时间内一定浓度的Ca2+异常增多，会使心脏二期平台期缩短，从而使心动周期缩短、心率加快[16]。这也说明了增加体内内源性的一氧化碳对心肌缺血再灌注损伤具有一定的保护作用。

综上所述，一氧化碳作为一种内源性气体分子，除了调节正常的生理活动外，其对心脏缺血性疾病可能具有至关重要的临床作用。通过内源性一氧化碳激动剂CoPP增加内源性一氧化碳，能对心脏的收缩功能起到维持稳定的作用，其具体的保护机制还需要进一步的研究阐明。

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The effect of endogenous carbon monoxide on myocardial ischemia reperfusion injury*

ZHOU Zhen，ZHANG Yu，JI Qiao-rong，LUI Jie，CAO Cheng-zhu，GAO Xiang，ZHANG Wei△

(High altitude medical research center of Qinghai University； The Key Laboratory of high altitude medical application of Qinghai Province，Xining，Qinghai 810001)

Objective To explore the effect endogenous carbon monoxide on myocardial ischemia reperfusion injuryafter Cobalt Protoporphyrin(CoPP)treatment.Method The rats were treated with CoPP(Agonist of endogenous carbon monoxide).The myocardial ischemia reperfusion model was established by Langendorff isolated cardiac perfusion system.The 1eft ventricular systolicpressure(LVESP)，1eft ventricular end-diastolic pressure(LVEDP)，1eft ventricular developed pressure(LVDP)，the maximum rate of left ventricular pressure(±dP/dtmax)were obtained.Result Before reperfusion，all parameters remained stable in control group and CoPP group，and no significant difference between the two groups.After reperfusion，the control group’s cardiac function decreased significantly(P<0.05)，the LVESP decreased 19%，+dP/dtmaxdecreased 28.5% and -dP/dtmaxdecreased 33.6%.Compared with the control group，the CoPP group’s cardiac function did not change significantly，while still maintaining a relatively stable level.Conclusion The endogenous carbon monoxide has no effect on normal cardiac function，but it has positive effect on the cardiac abnormaldiastolic and systolic function，that protect the cardiac function from myocardial ischemia reperfusion injury.

Endogenous carbon monoxide Ischemia reperfusion injury Langendorff isolated cardiac perfusion system Cardiac diastolic and systolic function

*：国家自然基金项目(81560301；81160012)；教育部新世纪优秀人才项目(NCET-12-1022)；△：通信作者，博导，教授，zw0228@sina.com 周振(1991～)，男，汉族，陕西籍，硕士研究生；

R363

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2017.01.006

2017-02-20