苦刺总生物碱对LPS诱导小鼠急性肺损伤的保护作用※

赵鹏飞，刘绍能，马继征

(1.青海省第四人民医院 西宁 810000；2.中国中医科学院广安门医院 北京 100053)

苦刺总生物碱对LPS诱导小鼠急性肺损伤的保护作用※

赵鹏飞1，刘绍能2，马继征2

(1.青海省第四人民医院 西宁 810000；2.中国中医科学院广安门医院 北京 100053)

目的 探讨苦刺总生物碱对LPS所致急性肺损伤(ALI)模型小鼠的保护作用。方法 将小鼠分为空白组、模型对照组、地塞米松组、苦刺总生物碱低剂量组(46.65mg·kg-1)、苦刺总生物碱中剂量组(93.30mg·kg-1)、苦刺总生物碱高剂量组(186.60mg·kg-1)。各0受试药物组按体重灌胃给予相应药物(0.2mL·10g-1)，空白对照组与模型对照组给予等体积生理盐水，每日1次，连续给药7天。各组实验动物禁食不禁水12小时，实验当日，地塞米松组按体重腹腔注射给药(0.1mL·10g-1)1次，末次给药1小时后，除空白对照组小鼠腹腔注射等体积无菌生理盐水外，其余各组均按体重腹腔注射LPS(0.1ml ·10g-1)制备小鼠ALI模型。12小时后各组均取血，分离血清，收集肺泡灌洗液(BALF)。检测小鼠全血白细胞(WBC)计数及分类计数；肺指数；BALF中总蛋白含量；肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性；血清白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α( TNF-α) 含量，BALF中白介素-1β(IL-1β)、白介素-10(IL-10)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量。计算小鼠肺湿/干重(W/D)。结果 苦刺总生物碱明显降低ALI模型小鼠全血WBC水平，显著升高小鼠淋巴细胞(LY)计数；显著降低肺指数、肺W/D；明显降低BALF中总蛋白的含量、肺组织 MPO活性，显著降低血清IL-6、TNF-α含量及BALF中IL-1β、IL-10、MDA和NO的表达水平。结论 本研究结果显示，苦刺总生物碱对LPS所致ALI小鼠急性肺损伤具有明显保护作用，作用机制与抗氧化、抑制促炎因子的释放有关。

苦刺 总生物碱 脂多糖 急性 肺 损伤 保护

前期研究表明，苦刺(Sphora vieiifolia Hance)总生物碱抗炎活性良好，主要表现为其可显著降低二甲苯致小鼠耳肿胀度，降低醋酸致小鼠腹腔毛细血管的通透性。为进一步探讨其对急性肺损伤是否存在影响及可能影响机制，本研究应用苦刺总生物碱对LPS所致急性肺损伤(ALI)模型小鼠开展相关研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药物

苦刺经马继征博士鉴定为豆科槐属植物苦刺(Sphora vieiifolia Hance)的干燥根，其质量符合《云南省中药材标准(2005年版)》“白刺花根”项下相关标准。

1.1.2 实验仪器、试剂

旋转蒸发仪(型号：RE5203)，购自上海亚荣生化试剂厂；台式循环水式多用真空泵(型号：SHB-Ⅲ)，购自郑州长城有限公司；全波长多功能读数仪(型号：Varioskan Flash)，购自美国Thermo公司；全自动血液分析仪(型号：MEK-8222K)，购自日本Nihon Kohden公司。冰醋酸(批号：20150304)、二甲苯(批号：20150907)，均购自重庆茂业化学试剂有限公司。地塞米松磷酸钠注射剂(批号：1608042111)，购自福建南少林药业有限公司；LPS(E.col：055：B5)(批号：L-2880)，购自Sigma公司。小鼠 IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α ELISA 试剂盒(批号分别为：20151123、20151126、20151127、20151129)，均购自北京科盈美科技有限公司；BCA蛋白定量试剂盒(批号：P0010S)，购于碧云天生物技术研究所；髓过氧化物酶(MPO)试剂盒(批号：20150421)、丙二醛(MDA)试剂盒(批号：20151225)、一氧化氮(NO)试剂盒(批号：20151207)，均购自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 实验动物

昆明种小鼠，SPF级，雌雄各半，体重18～22 g，购于第三军医大学实验动物中心，合格证号：SCXX(军)2013-14。

1.2 实验方法

1.2.1 苦刺总生物碱的制备

取苦刺药材，适当破碎，加8倍量70%乙醇加热回流提取二次，每次50分钟，合并乙醇提取液，减压回收乙醇，得粗浸膏，加入3倍体积量的2%盐酸溶液，充分搅拌，静置过夜，过滤，收集水溶液，加入氨试液调pH至10，用等量氯仿振摇提取三次，收集氯仿层，无水Na2SO4脱水，减压回收氯仿，得脂溶性总生物碱；水相继续加入等量水饱和的正丁醇振摇提取三次，减压回收正丁醇，得水溶性总生物碱。脂溶性总生物碱和水溶性总生物碱之和即为总生物碱的量。经计算，总生物碱得率为3.11%。

供试药物采用0.50%吐温溶液配制，苦刺按成人(60kg)临床日用量15 g计，实验动物给药剂量分别按人用临床剂量的6、12、24倍，结合总生物碱出膏率进行换算，即为46.65、93.30、186.60 mg ·kg-1(提取物/体重)。

1.2.2 苦刺总生物碱对LPS所致小鼠急性肺损伤(ALI)模型的影响

1.2.2.1 实验动物分组、给药及ALI模型的建立

实验动物按体重分层，随机分为空白对照组、模型对照组、地塞米松组、苦刺总生物碱高剂量组(186.60mg·kg-1)、苦刺总生物碱中剂量组(93.30mg·kg-1)、苦刺总生物碱低剂量组(46.65mg·kg-1)，每组12只。各受试药物组按体重灌胃给予相应药物(0.2mL·10g-1)，空白对照组与模型对照组给予等体积生理盐水，每日1次，连续给药7天。各组实验动物禁食不禁水12小时，实验当日，地塞米松组按体重腹腔注射给药(0.1mL·10g-1)1次，末次给药1小时后，除空白对照组小鼠腹腔注射等体积无菌生理盐水外，其余各组均按体重腹腔注射LPS(0.1mL·10g-1)制备小鼠ALI模型。

1.2.2.2 实验指标

1.2.2.2.1 苦刺总碱对ALI小鼠全血白细胞计数及分类计数的影响：眼底静脉丛取血法取小鼠全血20 μL，至预先分装2 mL 稀释液的EP管中，充分混匀，通过全自动血细胞分析仪测定小鼠外周血白细胞总数，并对淋巴细胞(LY)、单核细胞(MO)分类计数进行考察。

1.2.2.2.2 苦刺总碱对ALI小鼠血清炎症细胞因子IL-6、TNF-α水平的影响：摘眼球法收集小鼠血液，离心(4℃，3500r/min)10 min，分取血清，ELISA法测定血清IL-6、TNF-α水平。

1.2.2.2.3 苦刺总碱对ALI小鼠BALF中总蛋白含量及IL-1β、IL-10、MDA、NO含量的影响：取血完成后，脱颈处死实验动物，剖开胸腔，暴露气管，结扎右肺，用4 ℃无菌PBS溶液灌洗左肺，16号针自口腔插入气管，固定后每次注入0.4 mL，注入后停留1 min，重复灌洗3次，收集BALF，离心(4℃，1000r/min)5 min，取上清液，BCA法测定BALF中蛋白含量，另按试剂盒说明书分别测定BALF中IL-1β、IL-10、MDA、NO含量。

1.2.2.2.4 苦刺总碱对ALI小鼠肺湿重(W)/干重(D)、肺指数及肺组织MPO活性的影响：迅速剖取已处死小鼠肺脏，称全肺湿重，计算肺指数；然后准确分取部分肺组织，称重(W)，放入60 ℃烘箱中干燥60小时，称取干重(D)，计算W/D值，反映肺组织的水肿程度；另取部分肺组织充分匀浆，制备10%肺组织匀浆液，按照MPO试剂盒说明书测定MPO活性。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 苦刺总生物碱对ALI小鼠外周血白细胞及其分类计数的影响

与空白对照组比较，模型组小鼠外周血WBC水平显著增高、LY计数显著降低，MO计数无显著改变，提示ALI小鼠炎症活动明显。与模型对照组比较，苦刺总生物碱各剂量均能明显降低ALI小鼠WBC水平和LY计数(P<0.01，P<0.05)；与地塞米松组比较，苦刺总生物碱各剂量组小鼠WBC水平显著升高(P<0.01)；与苦刺总生物碱186.60 mg·kg-1组相比，苦刺总生物碱93.30 mg·kg-1组实验动物外周血WBC水平显著降低(P<0.01)；与苦刺总生物碱93.30 mg·kg-1组相比，苦刺总生物碱46.65 mg·kg-1组小鼠外周血LY计数显著下降(P<0.05)，结果见表1。

Table 1 Effects of total alkaloids of Sphora vieiifolia Hance on the contents of WBC and differential blood count in peripheral blood of ±s)

*：与模型对照组比较P<0.05，**：P<0.01；#：与地塞米松组比较P<0.05，##：P<0.01；#：与苦刺总生物碱中剂量组比较P<0.05，##：P<0.01.

2.2 苦刺总生物碱对ALI小鼠血清IL-6、TNF-α水平及BALF总蛋白含量的影响

与空白对照组比较，模型组小鼠血清IL-6、TNF-α水平及BALF总蛋白含量显著升高(P<0.01，P<0.05)，表明模型组小鼠炎症模型复制成功；与模型对照组比较，苦刺总生物碱各剂量组均能显著降低ALI小鼠血清IL-6、TNF-α水平及BALF总蛋白含量，且随着剂量的增加，药效强度有增强的趋势(P<0.01)；与空白组相比，苦刺总生物碱93.30、46.65 mg·kg-1组实验动物血清TNF-α水平显著升高(P<0.05)，结果见表2。

Table 2 Effects of total alkaloids of Sphora vieiifolia Hance on IL-6，TNF-α in serum and the total protein concentration in BALF of ±s)

*与：模型对照组比较P<0.05，**：P<0.01；★：与地塞米松组比较P<0.05，★★：P<0.01；#：与苦刺总生物碱中剂量组比较P<0.05，##：P<0.01.

2.3 苦刺总生物碱对ALI小鼠BALF中炎症细胞因子IL-1β、IL-10、MDA、NO水平的影响

与空白对照组比较，模型组小鼠BALF中IL-1β、IL-10、MDA、NO水平显著升高(P<0.01，P<0.05)；与模型对照组比较，苦刺总生物碱各剂量组均能明显降低ALI小鼠BALF中IL-1β、IL-10水平(P<0.01)，苦刺总生物碱93.30、186.60 mg·kg-1能明显下降MDA、NO的表达水平(P<0.01)；与地塞米松组相比，苦刺总生物碱实验动物BALF中IL-1β、MDA、NO水平显著升高(P<0.01，P<0.05)；与苦刺总生物碱46.65 mg·kg-1组相比，苦刺总生物碱93.30、186.60 mg·kg-1组能显著降低MDA、NO含量(P<0.01，P<0.05)，结果见表3。

Table 3 Effects of total alkaloids of Sphora vieiifolia Hance on the level of IL-1β，IL-10，

*：与模型对照组比较P<0.05，**：P<0.01；#：与地塞米松组比较P<0.05，##：P<0.01；#：与苦刺总生物碱中剂量组比较P<0.05，##：P<0.01.

2.4 苦刺总生物碱对ALI小鼠肺湿重(W)/干重(D)、肺指数及肺组织MPO活性的影响

与空白对照组比较，模型组小鼠肺W/D值、肺指数及MPO活性显著升高(P<0.01，P<0.05)；与模型对照组比较，苦刺总生物碱93.30、186.60 mg·kg-1能明显降低ALI小鼠W/D值及肺指数(P<0.01，P<0.05)，各剂量均能明显降低ALI小鼠肺组织MPO活性(P<0.01)；与地塞米松组比较，苦刺总生物碱46.65、186.60 mg·kg-1组实验小鼠肺组织MPO活性显著降低(P<0.01，P<0.05)；与苦刺总生物碱46.65 mg·kg-1组比较，苦刺总生物碱93.30 mg·kg-1组小鼠肺组织MPO活性显著降低(P<0.05)，结果见表4。

Table 4 Effects of total alkaloids of Sphora vieiifolia Hance on the W/D，lung index and MPO activity of ±s)

*：与模型对照组比较P<0.05，**：P<0.01；#：与地塞米松组比较P<0.05，##：P<0.01；#：与苦刺总生物碱低剂量组比较P<0.05，##：P<0.01.

3 讨论

有研究显示，苦刺具有明显的抗炎作用[1]，课题组前期通过采用二甲苯致小鼠耳肿胀以及醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高两种急性炎症动物模型，观察苦刺不同提取部位的抗炎效应，结果发现苦刺总生物碱对两种急性炎症模型抑制效果明显，表明总生物碱是苦刺发挥抗炎效应的有效部位。

内毒素性急性肺损伤发病机理错综复杂，迄今尚未完全阐明，目前认为发病机理主要是致病因子对肺血管内皮细胞的直接损伤和全身炎症反应[2]。ALI的主要致病因子之一是LPS，LPS诱导的ALI动物模型可表现肺泡毛细血管和肺泡上皮弥漫性损伤、中性粒细胞浸润，并伴有肺水肿、甚至肺出血等病理症状[3]。本研究以LPS诱导的ALI小鼠模型为载体，观察苦刺总生物碱对模型小鼠的保护作用，可为苦刺药理作用的挖掘及其临床拓展应用提供实验依据。结果显示，腹腔注射LPS制备的ALI模型小鼠炎症活动明显，具体表现为：肺水肿明显，肺指数升高，外周血WBC水平增加，肺组织MPO活性、血清及BALF中炎症细胞因子水平均显著升高。苦刺总生物碱对ALI模型小鼠则有显著保护作用：减轻实验动物肺水肿症状，降低肺指数及外周血WBC水平，还可显著降低肺组织MPO活性及血清、BALF中IL-1β、IL-10、MDA、NO等促炎因子水平，进而显著减轻实验动物机体的炎性活动。实验结果证实了苦刺总生物碱为其主要抗炎物质基础之一，同时初步揭示了苦刺总生物碱抗炎作用机制与抗氧化、抑制促炎因子的释放有关。

[1]张明发，沈雅琴.苦刺总生物碱的抗腹泻和抗炎作用[J].中国药学杂志，1991，26(1)：20-23.

[2]吴岳，赵海龙，张伟，等.肺泡Ⅱ型细胞凋亡在急进高原大鼠早期肺损伤中的作用[J].青海医学院学报，2013，34(4)：233-236.

[3]张广梅，李福安，童丽.热痛方对大鼠急性肺损伤保护作用的实验研究[J].青海医学院学报，2006，27(2)：104-106.

Protection effects of total alkaloids ofSphoravieiifoliaHance on Lipopoly saccharide-induced Acute Lung Injury in Mice

ZHAO Peng-fei1，LIU Shao-neng2，MA Ji-zheng2

(1.The fourth people′s hospital of Qinghai Province，Xining 810000； 2.Guang An Men hospital，China academy of Chinese Medical sciences Beijing 100053)

Objective To investigate the protection effects of total alkaloids ofSphoravieiifoliaHance on Lipopolysaccharide(LPS)-induced acute lung injury(ALI)in mice.Method Mice were randomly divided into six groups，which including normal control group，ALI model group，ALI model+dexamethasone group，ALI model+total alkaloids ofSphoravieiifoliaHance(46.65mg·kg-1、93.30mg·kg-1、186.60mg·kg-1)groups.Except the dexamethasone group′s mice were given the drugs once time by i.p before experiment，other group′s were given drugs by intragastric administration once a day for 7 days.Then，the ALI model was established by intraperitoneal injection of LPS(10mg·kg-1)in mice after 1h of the last administration.12h after LPS injection，the blood，serum，bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were collected.White blood cell(WBC)content of blood，lung index，myeloperoxidase(MPO)activity in lung tissue，total protein concentration in BALF，and the level of IL-6，TNF-α in serum，IL-1β，IL-10，MDA，NO in BALF were measured respectively.Measure the ratio of wet lung to dry lung weight(W/D).Result The total alkaloids ofSphoravieiifoliaHance significantly decreased the WBC content in blood，increased lymphocyte(LY)count，as well as decreased the lung index，the value of W/D，MPO activity in lung tissue，the level of IL-6，TNF-α in serum and contents of IL-1β，IL-10，MDA and NO in BALF.Conclusion The results reveal that the total alkaloids ofSphoravieiifoliaHance show a protective action against the inflammatory pathological changes of lung tissue in ALI mice，and mechanisms underlying the action may be related to anti-oxidation and inhibiting the release of pro-inflammatory cytokines.

SphoravieiifoliaHance Total alkaloids Lipopolysaccharide Acute Lung Injury Protection

※：“西部之光”访问学者项目资助(2016) 赵鹏飞(1984～ )，男，汉族，陕西籍，主治医师

R774.1

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2017.01.012

2016-11-09