青海回族女性ApoB基因多态性与乳腺癌相关性

朱雪玲，赵 婧，李 萧，种晓艺，巩海凤，杨生玺，苏占海#

(1.青海大学研究生院；2.青海大学医学院；3.青海大学医学院基础医学部，基础医学研究中心，青海 西宁 810001)

青海回族女性ApoB基因多态性与乳腺癌相关性

朱雪玲1，赵 婧1，李 萧2，种晓艺2，巩海凤1，杨生玺3，苏占海3#

(1.青海大学研究生院；2.青海大学医学院；3.青海大学医学院基础医学部，基础医学研究中心，青海 西宁 810001)

目的 探讨青海地区回族女性ApoB基因516位C/T基因多态性与乳腺癌的相关性。方法 采用PCR方法扩增87例乳腺癌回族女性及50例正常回族女性的ApoB基因，用 EarⅠ限制性核酸内切酶切割目的基因，鉴定乳癌组与对照组ApoB基因516位C/T基因的基因型并计算各组等位基因频率，比较两组基因型及等位基因频率分布的差异，分析青海地区回族女性ApoB基因516位C/T基因多态性与其乳腺癌发生的相关关系。结果 乳癌组中CC、CT、TT型基因型频率分别为69.0%、19.5%、11.5%，对照组中分别为90.0%、4.0%、6.0%，两组中基因型分布存在差异(P<0.05)，乳癌组中TT、CT基因型的个体多于对照组；乳癌组中C、T等位基因频率分别为78.7%、21.3%，对照组中C、T等位基因频率分别为92.0%、8.0%，两组中C、T等位基因频率分布存在差异(P<0.05)，乳癌组T等位基因的频率比对照组高。结论 青海地区回族女性ApoB基因516位C/T基因多态性与其乳腺癌的易感性有关。

ApoB基因 乳腺癌 回族 女性 基因多态性

近年来，乳腺癌发病率逐年上升且发病年龄提前[1～4]。有研究显示，青海地区35岁以前回族乳腺癌的发病率高于汉族[5]。有研究发现脂代谢异常可促进女性乳腺癌的发生[6～7]。载脂蛋白在脂代谢过程中起着重要的作用，血浆中存在多种载脂蛋白，以载脂蛋白B的作用最为突出，ApoB基因具有多态性，据报道ApoB基因第516位基因多态性与女性乳腺癌的发生有关[8]。本研究探讨ApoB基因516位基因多态性与青海地区回族女性乳腺癌易感性的关系。

1 材料与方法

1.1 乳癌组与对照组外周血标本

乳癌组为在青海大学附属医院、青海省人民医院和青海省红十字医院确诊为乳腺癌的回族女性，共87人。对照组为在青海大学附属医院体检中心进行体检的健康回族女性，共50人。两组实验对象均没有乳腺癌的家族史，经知情同意后，抽取外周静脉血2 mL于含抗凝剂的血常规管中，于-80 ℃冰箱冻存备用。

1.2 试剂与仪器

组织基因组DNA提取试剂盒、核酸染料(上海天根，中国)；无水乙醇、1×TAE缓冲液、低熔点DNA琼脂糖(上海生工，中国)；TaqDNA酶、10×PCRBuffer[without Mg2+：100 mMTris-HClpH8.8 at 25 ℃，500 mM KCl，0.8 %(v/v) Nonidet ](北京康润，中国)；MgCl2(25mM)、dNTP(10mM)、DNA Marker(BBI，加拿大)；6×DNA Loading Dye(上海赛默飞，中国)；PCR产物纯化回收试剂盒(上海生工，中国)；EarⅠ限制性内切酶(MBI，加拿大)；胎牛血清白蛋白(BSA，上海碧云天)。

PCR反应扩增仪(BBI公司，加拿大)；DK-8D型电热恒温水槽(上海森信，中国)；DYY-8型稳压稳流电泳仪(上海琪特，中国)；水浴锅、摇床、震荡器(北京六一，中国)；YXJ-2离心机(湖南湘仪，中国)；H6-1微型电泳槽(上海精益，中国)；Gene Genius-凝胶成像系统(Syngene公司，英国)。

1.3 方法

1.3.1 外周血基因组DNA提取

按组织基因组DNA提取试剂盒的操作步骤提取外周血基因组DNA，用核酸浓度测定仪检测所提外周血基因组DNA的浓度与纯度(A260/A280在1.8～2.0之间，DNA纯度较高)，样品于-20 ℃保存。

1.3.2 目的基因PCR扩增

通过查阅文献，确定上游引物序列为5′-GCTGGGGTTTCTTGAAGACA-3′，下游引物序列为5′-CAAGCGTCTTCAGTGCTCTG-3′，目的片段长度为422 bp[8]。引物由上海生工生物公司合成。扩增目的片段，PCR反应体系见表1。PCR反应条件是95 ℃预变性5 min，95 ℃ 30 s，67.5 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，循环20次，72 ℃ 5 min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，凝胶成像系统记录结果。

表1 PCR反应体系Table 1 PCR reaction system

1.3.3 基因型检测

取PCR产物10 μL，加入无菌水5 μL、10×PCR Buffer2 μL、0.1%BSA 2 μL、限制性核酸内切酶EarⅠ2 μL，37 ℃水浴16 h，对PCR产物进行酶切。酶切产物上样于1%琼脂糖凝胶电泳，置于凝胶成像系统记录结果。

1.3.4 统计学处理

应用spss19.0软件，采用χ2检验比较乳癌组与对照组基因型及等位基因频率分布的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 PCR扩增目的基因电泳检测

提取的乳癌组与对照组外周血基因组DNA经PCR扩增后，电泳检测扩增产物。422 bp的目的基因片段扩增成功(条带清晰，图1)。

A：对照组；B：乳癌组；M：Marker；1-15、1-10：DNA样本

图1 ApoB基因PCR产物电泳图
Figure 1 Electrophoresis of ApoB gene PCR products

2.2 基因型鉴定

PCR扩增产物经EarⅠ限制性核酸内切酶切割后，用凝胶呈像系统检测记录结果。结果只显示一条422 bp的条带，则基因型为CC型；显示306 bp和116 bp两条条带，则基因型为TT型；显示422 bp、306 bp和116 bp三条条带，则基因型为CT型(图2-3)。

M：Marker；1-9：DNA样本

图2 对照组ApoB基因型分析图
Figure 2 Analysis diagram of ApoB genotype in control group

M：Marker；1-8：DNA样本

2.3 ApoB基因-516位基因型频率分析

乳癌组中基因型为CC、TT、CT型的个体分别有60例、10例、17例，各基因型的频率分别为69.0%、11.5%和19.5%。对照组中基因型为CC、TT和CT型的个体分别有45例、3例、2例，各基因型的频率分别为90.0%、6.0%、4.0%。两组中ApoB基因516位基因型频率分布存在差异(P<0.05)，乳癌组中TT、CT基因型频率高于对照组(表2)。

表2 乳癌组与对照组ApoB基因516位基因型频率分布Table 2 Frequency distribution of ApoB gene 516 genotype in breast cancer group and control group

2.4 ApoB基因516位C、T等位基因频率分析

乳癌组中C、T等位基因频率分别为78.7%、21.3%，对照组中C、T等位基因频率分别为92.0%、8.0%(表3)。两组中C、T等位基因频率的分布存在差异(P<0.05)。

表3 乳癌组与对照组ApoB基因516位C、T等位基因频率分布Table 3 Frequency distribution of ApoB gene 516 C，T allele in breast cancer group and control group

3 讨论

统计数据显示乳腺癌的发病率位列女性恶性肿瘤的首位，居全国恶性肿瘤的第二位[9]。近年来我国乳腺癌的发病率和死亡率均呈现上升趋势，城市的增加幅度高于农村[2]。霍新龙研究发现乳腺癌发生和远处转移与血脂异常有关[10]。美国德克萨斯大学西南医学中心的科研人员发现胆固醇的代谢产物具有雌激素样的作用，可促进乳腺癌细胞的增殖[11]。载脂蛋白(apoprotein)主要参与体内脂质的结合、转运及代谢等过程。目前从人血浆中分离出的载脂蛋白达20余种，主要分为ApoA、ApoB、ApoC、ApoD、ApoE五大类。其中ApoB在体内主要以ApoB48和ApoB100两种形式存在，二者分别是乳糜微粒(CM)和低密度脂蛋白(LDL)的组成成分。ApoB100与LDL代谢有关，LDL主要通过受体介导的途径代谢，LDL与LDL受体(LDLR)结合后与ApoB100结合形成复合物被转运至溶酶体中进行降解，从而实现LDL的代谢。金吉钟等发现体内LDL含量增高可刺激机体分泌雌激素、胰岛素等激素而导致乳腺癌的发生[12]。蒋圣早等研究发现血清中ApoB和LDL的水平与乳腺癌的发生成正相关[13]。

研究发现乳腺癌与肥胖的发生密切相关，脂肪组织可分泌芳香化酶将体内的雄激素转化为雌激素，使体内雌激素水平升高，进而增加乳腺癌的发生风险[14～17]。ApoB基因是一种肥胖相关基因，位于2号染色体短臂，由28个内含子和29个外显子组成，全长43 kb，含6个ALΜ重复序列。该基因存在多态性，共有75处核苷酸突变位点，可发生有意义突变的位点有54处，其多态性是以碱基的缺失或插入为基础的[18]。Xiaoyi Liu等研究发现，ApoB基因rs693位点和rs1042031位点的多态性可增加中国女性乳腺癌的发生风险[19]。Pandey SN等研究结果显示，ApoB基因及单体型信号肽的多态性与胆囊癌的发生没有直接的关系，但是用最大期望值法可得到四种单体型的基因型个体，基因型为X(+)，D的单体型个体不论是否有胆囊结石的病史，其发生胆囊癌的风险都会增加[20]。有研究发现，ApoB基因XbaI位点的多态性是胆囊癌发生的一个危险因素[21]。目前关于ApoB基因516位C/T基因多态性与肿瘤发生关系的研究较少。本研究通过分析青海地区回族女性ApoB基因516位C/T基因的基因型及等位基因频率分布的差异，揭示乳癌的发生与ApoB基因516位C/T基因多态性的关系。

在青海回族女性中ApoB基因516位C/T基因具有多态性，乳癌组与对照组中该基因的基因型及等位基因频率分布均存在差异。此外，乳癌组中基因型为TT、CT型个体多于对照组且乳癌组中T等位基因的频率高于对照组，ApoB基因516位T等位基因可能使青海地区回族女性乳腺癌的发生风险增加(P<0.05)。这与霍慧霞在汉族人群中的研究结果一致[8]，提示该基因位点的多态性与乳腺癌的易感性的联系可能不存在民族差异。本研究的结论是在仅分析了该基因的基因型及等位基因频率分布的基础上得出的，并未结合组织病理学特征进行分析。要将研究结果推广到不同民族，还需结合临床病理资料进一步研究包括藏族、土族等不同民族ApoB基因516位C/T基因多态性与女性乳腺癌的相关性。

[1]方琼英，吴琼，张秀玲，等.乳腺癌的流行现状分析[J].中国社会医学杂志，2012，29(5)：333-335.

[2]郑莹，吴春晓，张敏璐.乳腺癌在中国的流行状况和疾病特征[J].中国癌症杂志2013，23(8)：561-569.

[3]陈万青，郑荣寿.中国女性乳腺癌发病死亡和生存状况[J].中国肿瘤临床，2015，42(13)：668-674.

[4]Zheng Guopei，PengFang，Ding Renkui，et al.Identification of proteins responsible for multiple drug resistance in 5-fluorou-racil-induced breast cancer cell using proteomics analysis[J].Cancer Res Clin Oncol，2010，136(10)：1477-1488.

[5]姜军.青海地区乳腺癌发病特点及HIF2ɑ、CA9、CA12在乳腺癌发病机制中的探索研究[D].青海大学，2015.

[6]杨璇，高润芳.代谢综合征与乳腺癌的发生与预后[J].中国肿瘤外科杂志，2012，4(5)：288-291.

[7]郑芳，赵金波.血脂水平与乳腺癌关系的研究进展[J].医学综述，2015，21(21)：3913-3915.

[8]霍慧霞.ApoB基因多态性与乳腺癌的相关性研究[D].青岛大学，2012.

[9]陈万青，郑荣寿，曾红梅，等.2011 年中国恶性肿瘤发病和死亡分析[J].中国肿瘤，2015，24(1)：1-10.

[10]霍新龙.血脂、D-二聚体和CA153联合检测在乳腺癌中的临床意义[D].河北医科大学，2013.

[11]JocelynKaiser.Cholesterol forges link between obesity and breast cancer[J].Science，2013，342(6162)：1028.doi：10.1126/science.342.6162.1028.

[12]金吉钟，冯燕，王云峰，等.血脂水平与乳腺癌发生的临床关系研究[J].中国实验诊断学，2014，18(1)：109-110.

[13]蒋圣早，陈东祥.血清血脂及载脂蛋白水平与乳腺癌的相关性[J].中国现代医生，2015，53(14)：17-20.

[14]Margot P.Cleary，M.E.Grossmann，A.Ray.Effectof obesity on breast cancer development[J].Vet Pathol，2010，47(2)：202-213.

[15]Aguilar Cordero MJ，Gonzalez Jimenez E，García Lopez AP，et al.Obesity and its implication in breast cancer[J].Nutr Hosp，2011，26(4)：899-903.

[16]Yu ZG，Jia CX，Geng CZ，et al.Risk factors related to female breast cancer in regions of northeast China：a 1：3 matched case-control population-based study[J].Chin Med J，2012，125(5 )：733-740.

[17]Rose DP，Vona-Davis L.Interaction between menopausal status and obesity in affecting breast cancer risk[J].Maturitas，2010，66(1)：33-38.

[18]迟晔虹，黄刚.ApoB基因多态性与心脑血管疾病的相关性研究进展[J].临床和实验医学杂志，2013，12(2)：151-152.

[19]Xiaoyi Liu，Yu Wang，Huili Qu，et al.Associations of Polymorphisms of rs693 and rs1042031 in Apolipoprotein B Gene With Risk of Breast Cancer in Chinese[J].Jpn J Clin Oncol.，2013，43(4)：362-368.doi：10.1093/jjco/hyt018.

[20]Pandey SN1，Srivastava A，Dixit M，et al.Haplotype analysis of signal peptide(insertion/deletion)and XbaI polymorphisms of the APOB gene in gallbladder cancer[J].Liver Int.，2007，27(7)：1008-1015.

[21]Singh MK1，Pandey UB，Ghoshal UC，et al.Apolipoprotein B-100 XbaI gene polymorphism in gallbladder cancer[J].Hum Genet.，2004，114(3)：280-283.

Association of ApoB gene polymorphism with breast cancer in the Hui ethnic female in Qinghai region

ZHU Xue-ling1，ZHAO Jing1，LI Xiao2，ZHONG Xiao-yi2，GONG Hai-feng1，YANG Sheng-xi3，SU Zhan-hai3#

(1.Department of Postgraduate，Qinghai University；2. Qinghai University Medical College； 3.Department of Basic Medical Sciences and Basic Medical Research Center， Qinghai University Medical College，Xining，Qinghai，810001)

Objective To investigate the association of the ApoB gene 516 C/T polymorphism with breast cancer in Hui ethnic female in Qinghai region.Methods ApoB gene was amplified by PCR method in 87 cases of breast cancer and 50 normal female.By using EarⅠrestriction enzyme to cleavage ApoB gene and identify 516 C/T gene polymorphism.Breast cancer group and control group were identified，and calculate the allele frequencies in each group.To compare the difference of the frequency distribution of genotype and allele between the breast cancer group and the control group.To analyze the relationship between the polymorphism of ApoB gene 516 C/T gene and breast cancer in Hui ethnic female in Qinghai region.Results The frequency of CC，CT and TT genotype in breast cancer group was 69.0%，19.5% and 11.5%，respectively.The frequency of CC，CT and TT genotype in control group was 90.0%，4.0% and 6.0%，respectively.There showed a difference in genotype distribution between the breast cancer group and the control group(P<0.05)，and the TT and CT genotype in the breast cancer group were more than those in the control group；The frequency of C and T allele in breast cancer group were 78.7% and 21.3%，respectively.The frequency of C and T allele in control group weres 92.0% and 8.0%，respectively.In the breast cancer group and the control group，C，T allele frequency distribution were different(P<0.05)，the frequency of T allele in breast cancer group was higher than that in control group.T allele increased the risk of breast cancer in Hui ethnic female in Qinghai region.Conclusion The ApoB gene 516C/T gene polymorphism is associated with the susceptibility of breast cancer in Hui ethnic female in Qinghai region.

ApoB gene Breast cancer Hui ethnic Female Gene polymorphism

R730.4

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2017.01.008

2016-06-02

朱雪玲(1992～)，女，汉族，天津籍，在读硕士. #：通讯作者，教授，硕士生导师，suzhanhai@qhu.edu.cn