血小板源性生长因子在富血小板血浆治疗高原地区脊柱结核病中的作用机制研究※

李钊伟，李泽清，唐保明，李春亮，赵 磊，杨爱荣

(1.青海大学附属医院创伤骨科；2.青海大学附属医院；3.青海省人民医院骨科；4.青海大学医学院预防医学系)

血小板源性生长因子在富血小板血浆治疗高原地区脊柱结核病中的作用机制研究※

李钊伟1，李泽清1，唐保明1，李春亮3，赵 磊4，杨爱荣△2

(1.青海大学附属医院创伤骨科；2.青海大学附属医院；3.青海省人民医院骨科；4.青海大学医学院预防医学系)

目的 观察富血小板血浆对高原地区脊柱结核病治疗的影响，了解血小板源性生长因子在富血小板血浆治疗高原地区脊柱结核病的作用机制。方法 收集本院自2013年3月～2016年3期间青海本地脊柱结核患者，根据患者术中是否经PRP治疗分为PRP组和非PRP组，术后给予相同治疗，并于术后连续4周每周复查各组患者CRP、ESR值；12只家兔随机分为两组(实验组和对照组)，每组6只，无菌操作去除各组家兔椎体侧方1 cm×1 cm骨组织，用咬骨钳将其咬碎备用，实验组骨组织与预先制备好的PRP混合，并植入对应家兔骨缺损处；对照组骨组织与等体积的生理盐水混合，并植入对应家兔骨缺损处，术后分笼常规饲养。8周后无菌获取各组适量骨缺损处组织，置于液氮速冻再移至-80 ℃冰箱暂存，采用Western Blot技术检测各组骨缺损处组织PDGF、AP-1以及IL-6蛋白的表达水平。结果 PRP组(n=61)和非PRP组(n=57)治疗脊柱结核病均达到治愈，但PRP组术后复发感染、血肿以及窦道均比非PRP组少；术前PRP和非PRP组ESR、CRP值差异无统计学意义(P>0.05)，但PRP组和非PRP组术后2、3、4周ESR和CRP值变化差异均有统计学意义(P<0.05)，且均随术后时间延长而降低。12只家兔，造模前后无感染和死亡，均进入结果分析，无托失值；家兔PRP组和对照组骨缺损处组织PDGF、AP-1以及IL-6蛋白的表达水平变化差异有统计学意义(P<0.05)，且PRP组三种蛋白表达水平均明显升高。结论 血小板源性生长因子可能通过PDGF、AP-1以及IL-6蛋白改变发挥减少脊柱结核患者术后并发症的作用，提高富血小板血浆治疗高原地区脊柱结核病术后伤口愈合效果。

高原脊柱结核 血小板源性生长因子 富血小板血浆

脊柱结核在青藏高原居民中发病率、凸畸形发生率和截瘫等严重并发症几率都较高[1]。目前国内外治疗脊柱结核的主流方法为药物抗痨基础上，行病灶清除植骨融合内固定手术治疗，但术后易有结核感染复发、窦道形成等并发症。在主流方法基础上加入富血小板血浆(Platelet-rich plasma，PRP)辅助治疗是我们正在探索的新的治疗手段，PRP是通过离心自体血而得到的含有高浓度血小板的血浆，能加速多种组织修复愈合，并有良好的抗感染作用。PRP主要成分之一血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)是一种重要的血管形成刺激因子，在组织生长、修复和再生过程中具有重要的调节作用。PDGF可刺激、提高体外培养成骨细胞白细胞介素-6(interleukin- 6，IL-6)的转录水平，但此作用在体内实验中少见有报道[2]。激活子蛋白-1(activator protein 1，AP-1)是一种重要的转录因子，调控IL-6的表达[3]。本文在回顾性分析PRP治疗高原地区脊柱结核病的效果的基础上，用成熟家兔建立脊柱椎体骨缺损模型，检测PRP的最主要成分PDGF在脊柱椎体骨缺损愈合中发挥的作用机制，为高原地区脊柱结核治疗探索新的方法，并提供相应的理论依据。

1 资料与方法

1.1 患者一般资料和观察指标

2013年3月至2016年3月，在青海大学附属医院手术治疗脊柱结核病例118例，其中男性39例，女性79例。患者平均年龄53.55±4.7岁，均来自青海省高海拔地区，平均居住海拔3487米，67%为藏族等少数民族。脊柱结核分布节段为颈椎结核4例、胸椎结核41例、腰胸段结核12例、腰椎结核58例，腰骶段结核3例。患者均符合以下脊柱结核病诊断标准：(1)有不同程度的颈、背部疼痛，胸腹部及肢体放射痛，部分有盗汗、午后低热、体重减轻等结核典型症状；(2)病灶标本经Bactec960系统快速结核菌培养阳性或者病理检查确诊结合；(3)X线片、CT及MR检查符合脊柱结合改变。治疗后观察术后四周C反应蛋白(C-Reactive Protein，CRP)、血沉(Erythrocyte Sedimentation Rate，ESR)及窦道、感染和血肿是否发生等。

1.2 患者手术治疗方法

1.2.1 术前准备

对患者的一般情况、生化指标进行常规检查以评估患者对手术的耐受程度。所有患者进行四联抗痨治疗3周以上，每周复查ESR，患者结核中毒症状减轻，ESR持续降低并达40 mm/h以下时手术。

1.2.2 PRP采集制备输注

术前自患者肘部取外周静脉血20～60 mL，离心(350g×5min)后收集 PRP，将其再次离心(50g×5min)浓缩至 4～12 mL。所用材料为3.8% 柠檬酸钠抗凝(美国sigma公司)；5 mL 离心管(德国GIBCO公司)，XL90 超速低温离心机(美国Beckman公司)。

1.2.3 术中治疗

患者均采用全身麻醉，根据患者病变部位具体情况，行前路或后路病灶清除、植骨、内固定术治疗。将患者分为PRP组和对照组，PRP组在手术入路缝合后将收集的PRP注射到脊柱患处。

1.2.4 术后处理

术后PRP组和对照组处理相同：病灶行病理检查，术后继续抗痨治疗10～12个月。术后连续4周每周复查CRP、ESR。

1.3 脊柱椎体骨缺损模型及组织提取方法

用12只家兔(体重2.5～3.0kg，雌雄不限)建立脊柱椎体骨缺损模型，随机分两组(每组6只)，即PRP治疗组和对照组。两组家兔分别腹腔内注射5%利多卡因10 mL，待麻醉完全后将家兔置于手术架上，取腹部正中缺口，剥离腹部浅层肌肉，打开腹膜后用腹壁拉钩牵开肠道及软组织，暴露椎体前方，用小号骨凿去除椎体侧方1 cm×1 cm骨组织，去除的骨组织用咬骨钳咬碎，PRP治疗组骨组织与预先制备好的PRP混合后植入骨缺损处，对照组混合相同体积的生理盐水。丝线小心地间断封闭切口，造模成功手术之后将家兔分笼正常饲养。饲养八周后切开手术部位取一定量骨缺损处组织。所有取出的组织标本立即置液氮中速冻，然后转移至-80 ℃冰箱中保存。

1.4 Western Blot检测方法

用组织总蛋白质提取试剂盒提取骨缺损组织总蛋白质，检测浓度后进行SDS-PAGE电泳，转PVDF膜后用5% BSA封闭1 h，加入一抗(PDGF为1：300，AP-1为1：500，IL-6为1：500，β-acting为1：10000)4 ℃过夜。用TBST洗膜3次，每次10 min，加入HRP标记的二抗(1：10000)37 ℃摇床孵育1 h，TBST 洗膜3次(10min/次)，然后显色。将胶片进行扫描、拍照，经Bio-Rad Quantity one 4.4.0图像分析系统采集图像，采用β-acting作为内参，以光密度比值表示该蛋白相对表达水平。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 临床结果

2.1.1 患者术后情况

根据术后随访资料，按照脊柱结核临床治愈标准，PRP组和非PRP组均达到治愈，但非PRP组有1例(1.63%)术后切口边缘部分坏死，愈合不良，局部分泌物培养阴性，换药3周而愈。且非PRP组感染复发1例(1.75%)、窦道发生4例(7.02%)、术后血肿3例(5.26%)；PRP组感染复发1例(1.64%)，血肿1例(1.64%)，无窦道发生，两组显著性检验结果差异无统计学意义。

2.1.2 患者ESR和CRP检测结果

PRP组和非PRP组术前ESR和CRP比较，差异无统计学意义(P>0.05，表1)；两组术前、术后2、3、4周比较，差异均有统计学意义(P<0.05，表1)。

2.2 动物实验Western Blot检测蛋白质表达结果

家兔PRP组和对照组骨缺损处组织PDGF、AP-1和IL-6三种蛋白质表达检测结果可以看出，和对照组相比，PRP组的AP-1和IL-6三种蛋白质表达水平均明显升高(图1)，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

表1 PRP组和非PRP组患者术前、术后2周、3周、4周CRP和ESR比较Table 1 Comparison of ESR and CRP between PRP group and non-PRP group before and 2，3，4 weeks after the surgery

图1 PDGF、AP-1和IL-6蛋白在PRP组和对照组的表达结果图
Figure 1 The expression of PDGF、AP-1 as well as IL-6 protein in PRP group and control group

表2 PDGF、AP-1和IL-6蛋白在PRP组和对照组的表达结果Table 2 The expression of PDGF、AP-1 as well as IL-6 protein in PRP group and control ±s)

3 讨论

研究成果表明，与组织创伤修复过程密切相关的生长因子有血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子以及表皮生长因子等[4，5]，其作用机制主要是通过影响肉芽组织的生长、血管再生、再上皮化，决定组织创伤修复的速度[6，7]。近年研究发现，血小板衍生生长因子可促进骨组织损伤的修复，然而机制并不清楚。

炎性反应标志物是近年研究的一个方向，以CRP和ESR为代表，其中CRP为重要的急性时相反应蛋白，在急性创伤、感染时血浆中CPR和ESR水平均会急剧升高，这样可以影响损伤病灶[8]。

有研究表明[9]，感染组和非感染组患者CRP水平术后第1、3天有明显增高趋势，第7天则有回落，并以感染组变化更为明显，表明CRP升高与术后感染及炎症程度有关，且对判断临床术后感染及炎症程度有一定意义。王佳[10]、彭丽萍[11]和陈昌博[12]等均得出一致结论，即CRP、ESR的含量与感染以及炎症程度呈正相关。此外，有研究表明，血清中大分子蛋白如CRP和球蛋白等可加快血沉，当血清中IL-6含量减少时，血沉速度自然减缓[13]。

本研究发现，PRP治疗后患者血清中CRP和ESR下降速度较非PRP组快，且术后伤口感染率、血肿率以及窦道的形成数目较少，提示PRP可能通过减少感染以及抗炎作用，导致患者CRP以及ESR值下降，进而加快术后创伤的愈合速度。

PDGF是一种重要的生长刺激因子，有促进新毛细血管的形成、组织的生长、修复再生的作用[13]。研究表明[7，14]，外源性PDGF可以促进难愈性皮肤溃疡损伤创面的愈合，并认为高剂量的PDGF可加速上皮移行速率，提早出现肉芽组织、成纤维细胞以及新生毛细血管。Kim等[15]研究表明，经PRP处理后骨密度增加，由此可知PRP可能促进新骨的形成。本研究中家兔经PRP处理后骨缺损处PDGF蛋白含量升高，提示PDGF可能是通过刺激骨缺损处新骨以及新毛细血管的形成，促进骨缺损处的愈合。

AP-1是细胞内的一个转录激活因子，是由c-Fos和c-Jun组成的异二聚体，它通过调节基因的表达来应对多种刺激，包括细胞因子，生长因子，细菌和病毒感染等[13]。研究表明[16，17]，AP-1表达调控多种细胞的生理代谢，包括细胞分化、增殖和凋亡，且认为AP-1表达升高时通过调控生长因子的表达促进细胞增殖。Kido[18]等研究表明，负荷应激下可通过促进FosB AP-1家庭成员的表达，促进成骨细胞分化。本实验中经PRP处理后AP-1蛋白表达升高，可能是通过调控生长因子的表达，促进细胞的增殖，加速骨缺损处组织的愈合。

IL-6是由活化的T细胞和成纤维细胞产生的淋巴因子，能使B细胞前体成熟并产生抗体，与集落刺激因子协同，能促进原始骨髓源细胞的生长和分化，增强自然杀伤细胞的裂解功能[13]。本实验中经PRP处理后骨损伤处组织IL-6表达水平升高，可能是因为富血小板血浆制备过程中没有将白细胞去除，而是保留了全血中绝大部分的淋巴细胞，还有骨损伤刺激下产生的大量淋巴因子[19]；IL-6升高还有可能与AP-1蛋白表达升高有关，AP-1可调控IL-6的表达[3]。此外，有研究表明[20，21]，IL-6与TNF-α表达升高时均可增强破骨细胞的破骨功能，加速骨溶解过程。本实验中经PRP处理后IL-6表达升高，说明在骨组织损伤之后，机体可能通过促进AP-1蛋白的表达，升高IL-6的表达水平，增强破骨细胞的活性，加速已损伤骨细胞的处理过程，为新骨的形成提供原料。

综上所述，本研究结果显示，血小板源性生长因子可减少术后复发感染率、血肿以及窦道的形成，促进高原脊柱结核病患者术后创面愈合，其作用机制可能通过升高骨组织损伤处PDGF、AP-1和IL-6三种蛋白的表达水平，进而影响肉芽组织的生长、血管再生、新骨组织的形成以及损伤骨组织的清除过程。

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The mechanism study of platelet derived growth factor in the platelet-rich plasma treating spinal tuberculosis in high altitude area※

LI Zhao-wei1，LI Ze-qing1，TANG Bao-ming1，LI Chun-liang3，ZHAO Lei4，YANG Ai-rong△2

(1.Trauma department of orthopedics，Qinghai university affiliated hospital； 2.Qinghai university affiliated hospital； 3.Department of orthopedics，Qinghai Provincial People′s Hospital； 4.Department of preventive medicine；Qinghai University School of Medicine)

Objective By observing the influence of platelet-rich plasma on the treatment of spinal tuberculosis in high altitude area，we sought to test the molecular mechanism of platelet-derived growth factor in the platelet-rich plasma in the treatment of spinal tuberculosis.Methods During 2013/03-2016/03，we enrolled spinal tuberculosis patients in Qinghai University affiliated hospital who were all from Qinghai area.The patients who were under the PRP therapy entered into the PRP group and the rest entered into non-PRP group.Then give them the same treatment postoperatively.Finally，CRP and ESR of each patient in two groups were tested for four weeks.12 rabbits were randomly divided into 2 groups(the experimental group and the control group)，six rabbits in each group.Each rabbit were taken sterile operation to remove vertebral side 1 cm×1 cm bone tissue，rongeur were used to bite it.The bone tissue of PRP group was mixed with PRP which was prepared，implanted it into bone defect of corresponding rabbit；the bone tissue of the control group mixed with same volume of normal saline，implanted it into bone defect of corresponding rabbit；divided in cage raising for 8 weeks.A moderate amount of bone tissue was obtained from the bone lesions，which was firstly placed in liquid nitrogen and then moved to -80 ℃ refrigerator.Western Blot were used to test PDGF，AP-1 and IL- 6 protein level in each group of bone defect tissue.Results All patients of spinal tuberculosis were cured in the PRP group(n=61)and the non-PRP group(n=57)，but the case of infection，hematoma，postoperative recurrence and antrum in PRP group were less than that of the PRP group.There was no significant difference of ESR and CRP value between the PRP group and the non-PRP group preoperatively(P>0.05).The difference of ESR and CRP values had statistical significance(P<0.05)between the PRP group and the non-PRP group after using PRP therapy for 2weeks，3weeks，4 weeks，and the changing speed of ESR and CRP values in PRP group is faster than that of the non-PRP group.12 rabbits have no infection and death after process of model，the changes of PDGF，AP-1 and IL-6 protein expression level in the bone defect tissue of the PRP group and the control group was significantly different(P<0.05)，and those three protein expression levels were significantly increased in PRP group.Conclusions：PDGF may improve PRP treatment of spinal tuberculosis by increasing the expression level of AP-1 and IL-6，to reduce postoperative complications in patients with spinal tuberculosis.

Plateau spinal tuberculosis Platelet-derived growth factor Platelet-rich plasma

※：青海省科技厅自然科学基金项目(2014-ZJ-761)。Δ：通信作者，教授，Tel：13119762686 李钊伟(1971～)，男，汉族，青海籍，教授

R363.1

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2017.01.009

2016-10-01