PFTK1在食管鳞癌组织中的表达及意义

史琼琼，陈奎生

(郑州大学基础医学院病理学系、河南省肿瘤病理重点实验室，河南 郑州 450052)

PFTK1在食管鳞癌组织中的表达及意义

史琼琼，陈奎生

(郑州大学基础医学院病理学系、河南省肿瘤病理重点实验室，河南 郑州 450052)

目的 探讨PFTK1在食管鳞癌组织中的表达及意义。方法 采用免疫组化S-P法检测53例食管鳞癌组织、21例癌旁不典型增生组织和25例正常食管黏膜组织中PFTK1蛋白的表达；应用原位杂交技术检测53例食管鳞癌组织、21例癌旁不典型增生组织和25例正常食管黏膜组织中PFTK1 mRNA的表达。结果 食管鳞癌组织中PFTK1蛋白、mRNA表达明显高于癌旁不典型增生组织和正常食管黏膜组织，差异均有统计学意义(P均<0.05)。食管鳞癌组织中PFTK1蛋白、mRNA的阳性表达率与食管鳞癌分化程度、浸润深度及淋巴结转移有关(P均<0.05)，而与性别、年龄无关(P均>0.5)。结论 PFTK1的表达与食管鳞癌的发生、发展有关，其表达的升高可能促进食管鳞癌的发生、发展。

食管鳞癌；细胞周期蛋白依赖性激酶；免疫组化；原位杂交

PFTK1是一种重要细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinase，CDK)[1]。随着对PFTK1的深入研究，有证据表明PFTK1基因是一个十分有潜力的肿瘤相关基因。因此，进一步研究PFTK1的机制和功能将对肿瘤的转移机制及肿瘤的发生、发展提供新的认识，有为肿瘤治疗提供新靶点的可能。本研究采用免疫组化S-P法检测53例食管鳞癌组织、21例癌旁不典型增生组织和25例正常食管黏膜组织中PFTK1蛋白的表达；应用原位杂交技术检测53例食管鳞癌组织、21例癌旁不典型增生组织和25例正常食管黏膜组织中PFTK1 mRNA的表达，探讨PFTK1表达与食管鳞癌发生、发展的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料 标本选自河南科技大学第二附属医院2012年5月至2015年5月手术切除并明确诊断为食管鳞癌的新鲜标本，共53例，所有患者术前均未接受过放疗、化疗及其他相关治疗，并经常规切片证实为食管鳞癌。每例标本分别取食管鳞癌组织、癌旁不典型增生组织及正常食管黏膜组织(距癌灶边缘4 cm组织)。所取标本均用40 g·L-1甲醛固定，经常规脱水、石蜡包埋，4 μm厚连续切片。53例食管鳞癌患者中，男35例，女28例；年龄37～75岁，中位年龄55岁；病理类型：髓质型17例，溃疡型29例，伞型3例，缩窄型4例；组织学分级：Ⅰ级17例，Ⅱ级24例，Ⅲ级12例；临床分期：Ⅰ～Ⅱ期8例，Ⅲ～Ⅳ期45例；浸润黏膜下层或浅肌层6例，浸润深肌层或外膜层47例；有淋巴结转移25例，无淋巴结转移28例。

1.2 主要试剂 兔抗人CDK14单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；原位杂交5’端生物素标记PFTK1全硫代修饰探针(5’-GTGGGGAGTAGGTTGCATCT-3’)由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成。S-P免疫组化试剂盒、SA-AP显色试剂盒购自北京中山金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组化步骤 染色步骤按照免疫组化S-P法试剂盒说明进行，高压抗原修复，DAB显色，苏木素复染。采用已知阳性表达的组织切片为阳性对照，用PBS缓冲液代替一抗为阴性对照。

1.4 免疫组化结果判断 PFTK1阳性产物定位于细胞质中，阳性染色为黄色或棕黄色。PFTK1阳性表达根据阳性细胞的百分率判定，阳性细胞百分率计算：每张切片在400倍镜下分别取10个视野，分别计算阳性细胞的百分率，取其平均值，≤5%、>5%～25%、>25%～50%、>50%～75%、>75%分别计为0、1、2、3、4分。阳性细胞染色程度评分：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分。然后根据2项评分之和判断结果：0分为阴性，<3分为弱阳性(+)，3～6分为中度阳性(++)，>6分为强阳性(+++)。

1.5 原位杂交步骤 组织经新鲜配制二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水后，用新鲜配制的体积分数3% H2O2灭活内源性过氧化物酶；质量分数3%柠檬酸新鲜配制蛋白酶消化标本DNA结合蛋白；滴加不含探针的预杂交液(42 ℃)，预杂交4 h；滴加含探针的杂交液，42 ℃湿盒内杂交12 h；滴加SA-AP，37 ℃，30 min，BCIP/NBT避光显色2～4 h。用已知PFTK1 mRNA阳性表达的组织切片为阳性对照，用不含探针的预杂交液孵育标本为阴性对照。

1.6 原位杂交结果判读 PFTK1 mRNA阳性表达主要存在于细胞质中，阳性染色呈紫蓝色颗粒。PFTK1阳性表达根据阳性细胞的百分率判定，阳性细胞百分率计算：每张切片在400倍镜下分别取10个视野，分别计算阳性细胞的百分率，取其平均值，≤5%、>5%～25%、>25%～50%、>50%～75%、>75%分别计为0、1、2、3、4分。阳性细胞染色深度评分：无色为0分，淡紫蓝色为1分，紫蓝色为2分，深紫蓝色为3分。然后根据2项评分之和判断结果：0分为阴性(-)，<3分为弱阳性(+)，3～6分为中度阳性(++)，>6分为强阳性(+++)。

1.7 统计学处理 采用SPSS 20.0进行统计学分析，百分率比较采用校正χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 PFTK1蛋白在不同食管组织中的表达 PFTK1蛋白在食管鳞癌组织中的阳性表达率为71.7%(38/53)，显著高于癌旁不典型增生组织的38.1%(8/21)和正常食管黏膜组织的8.0%(2/25)，比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表1、图1。

表1 PFTK1蛋白在不同食管组织中的表达

2.2 PFTK1蛋白的表达与食管鳞癌患者临床病理参数的关系 PFTK1蛋白的阳性表达率与食管鳞癌分化程度、浸润深度及淋巴结转移均有关(P均<0.05)，而与患者的年龄、性别均无关(P均>0.05)。见表2。

2.3 PFTK1 mRNA在不同食管组织中的表达 食管鳞癌组织中PFTK1 mRNA的阳性表达率为83.0%(44/53)，显著高于癌旁不典型增生组织的38.1%(8/21)和正常食管黏膜组织的4.0%(1/25)，比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表3、图2。

2.4 PFTK1 mRNA的表达与食管鳞癌患者临床病理参数的关系 PFTK1 mRNA阳性表达率与食管鳞癌分化程度、浸润深度及淋巴结转移均有关(P均<0.05)，而与患者的年龄、性别均无关(P均>0.05)。见表4。

图1 正常食管黏膜组织(A)、癌旁不典型增生组织(B)和食管鳞癌组织(C)中PFTK1蛋白表达(S-P,×200)

表2 PFTK1蛋白的表达与食管鳞癌患者临床病理参数的关系

表3 PFTK1 mRNA在不同食管组织中的表达

3 讨论

PFTK1基因编码469个氨基酸，转录本约6 000 bp,位于人类的1号染色体的7q21.13,其催化结构域与Cdc2相关蛋白序列有高度的同源性，能调控细胞G1期向S期、G2期向M期转化。Cdc2相关蛋白是细胞周期进程的重要调节因子[2]。PFTK1在16种组织细胞中均检测到其转录本，尤其是在脑、胰腺、肾脏、心脏、睾丸和卵巢组织中表达显著。

图2 正常食管黏膜组织(A)、癌旁不典型增生组织(B)和食管鳞癌组织(C)中PFTK1 mRNA表达(ISH,×200)

表4 PFTK1 mRNA的表达与食管鳞癌患者临床病理参数的关系

Sy等[3]利用比较基因组杂交技术分析100例肝癌组织，发现染色体的7q21-q22在肝癌的晚期过表达。Pang等[4]采用高分辨率基因作图分析了5例肝癌组织染色体的7q21-q22，发现在这一区域PFTKl基因的拷贝数明显增加。进一步用RT-PCR检测了40例早期肝癌和48例晚期肝癌组织中PFTK1 mRNA表达水平，结果发现PFTK1 mRNA显著上调(P<0.032)，并且临床分期越晚，其肝癌组织的PFTK1 mRNA的表达水平越高，与肿瘤的恶性程度呈正相关。

PFTK1能促进肿瘤的转移，在乳腺癌组织中也发现PERK1的表达增加与其侵袭能力密切相关。一直认为细胞周期调节蛋白不影响细胞的迁移，但最近的研究发现在肿瘤组织中表达上调的Cdc2可以磷酸化钙调蛋白，后者被磷酸化后结合微丝能力增强，可以促进微丝有序聚合，从而增强细胞的迁移能力[5-6]。最近Miyagaki等[7]检测了PFTK1在77例食管鳞癌组织中的表达情况，发现PFTK1的表达是正常表皮细胞的2.61倍(P<0.001)。但有关PFTK1表达与食管鳞癌发生、发展的关系尚未见文献报道。

本研究结果显示，PFTK1蛋白、mRNA在食管鳞癌组织中阳性表达率明显高于癌旁不典型增生组织、正常食管黏膜组织(P均<0.05)，PFTK1蛋白、mRNA的阳性表达率与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移均有关(P均<0.05),而与患者的性别、年龄均无关(P均>0.05)。总之，PFTK1高表达可能与食管鳞癌发生、发展有关，该研究结果为进一步探讨食管鳞癌发生、发展机制提供了理论依据。

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Expression and Significance of PFTK1 in the Esophageal Squamous Carcinoma Tissues

SHI Qiongqiong，CHEN Kuisheng

(DepartmentofPathology,SchoolofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,450052,China)

Objective To investigate the expressions and clinical significances of PFTK1 in the esophageal squamous carcinoma tissues.Methods The expressions of PFTK1 protein and mRNA in the 53 cases of esophageal squamous carcinoma tissues,21 cases of adjacent atypical hyperplasia tissues and 25 cases of esophageal mucosa tissues were detected by immunohistochemistry and in situ hybridization.Results The expressions of PFTK1 protein and mRNA in the esophageal squamous carcinoma tissues were significantly higher than those in the adjacent atypical hyperplasia tissues and the normal esophageal mucosa tissues(P<0.05).The PFTK1 protein and mRNA positive expression rates were associated with tumor differentiation,tumor infiltration depth and lymph node metastasis(P<0.05),and had nothing to do with the age and gender(P>0.05).Conclusion PFTK1 higher expression may be related to the occurrence and development of esophageal squamous carcinoma.

esophageal squamous carcinoma; cyclin dependent kinase; immunohistochemistry; in situ hybridization

河南省基础与前沿技术研究计划项目(编号：142300410076)

史琼琼(1981-)，女，硕士在读，主治医师，主要从事肿瘤病理研究。E-mail:13295987955@163.com

陈奎生(1964-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事肿瘤病理研究。E-mail:chenks2002@163.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.02.002

R735.1；R730.23

A

1673-5412(2017)02-0097-04

2016-08-12)