电阻抗法快速测定巴氏杀菌牛乳中菌落总数

杜寒春，叶开富，刘绍刚，黄岛平，谭学才

（1.广西壮族自治区分析测试研究中心，南宁530022；2.广西民族大学化学化工学院,南宁530008）

电阻抗法快速测定巴氏杀菌牛乳中菌落总数

杜寒春1，叶开富1，刘绍刚2，黄岛平1，谭学才2

（1.广西壮族自治区分析测试研究中心，南宁530022；2.广西民族大学化学化工学院,南宁530008）

建立了电阻抗法快速测定巴氏杀菌牛乳中菌落总数的方法。得到的阻抗检测时间与菌落总数的标准曲线方程为y=-0.5923 t+9.4172，相关系数r=-0.9907，可信度高；其可信检测限为10～107mL-1，完全满足食品安全国家标准的要求；设立的样品评价标准可以快速、直观的对巴氏牛乳样品进行评价，在7.46 h内即可快速的判定样品是否合格，大大缩短了检测周期。结果表明，与国标法相比，电阻抗法简便快速、灵敏度高，又准确可靠，且适用于不同时期、来源及酸度的产品，具有广泛的适用性和实用性。

电阻抗法；巴氏杀菌牛乳；菌落总数

0 引言

巴氏杀菌乳(Pasteurized milk)是指仅以生牛（羊）乳为原料，经巴氏杀菌等工序制得的液体产品[1]。菌落总数是其重要的卫生指示指标，依据国标GB 4789.2[2]，需48 h±2 h才能得到结果，难以满足生产企业及市场监管检测快速、准确的要求。微生物自动快速检测系统BacTrac4300是基于电阻抗原理设计生产的一种微生物快速检测仪[3]，与传统方法相比，能更快速监测微生物的存在及数量。目前，电阻抗法在食品微生物快速检测中已得到广泛的应用[4-15]，但关于巴氏杀菌乳菌落总数快速检测的研究却报道不多[16-17]，且仅在实验室方法的初步探索阶段，真正从应用的角度来研究则鲜有报道。

本研究拟对电阻抗法在巴氏杀菌牛乳菌落总数快速测定中的应用进行探索和研究，为各乳品企业及检测机构提供技术参考。

1 实验

1.1材料与仪器

样品为市售的南宁五大品牌巴氏杀菌牛乳；稀释液为市售的UHT牛乳。

试剂为Bimedia002A培养基，平板计数琼脂，浓度为0.0905 mol/L氢氧化钠标准溶液（分析纯），柠檬酸钠(分析纯)。

仪器设备：微生物自动快速检测系统Bac⁃Trac4300，HVE-50型全自动高压灭菌锅，HH·B11型电热恒温培养箱，OK-S26型恒温水浴箱，VOR⁃TEX-GENIE 120型涡旋振荡器，SG2型pH计，Me⁃trohm 836 Titrando全自动电位滴定仪。

1.2方法

1.2.1 常规方法

按GB 4789.2-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》进行平板菌落计数。

1.2.2 电阻抗法

（1）巴氏杀菌乳标准样品的制备。将UHT牛乳分装9 mL/支作为稀释液，取自然腐败（保存条件下自然增殖）的高污染样品进行梯度稀释，得到系列污染程度不同的标准样品。

（2）临界值的确定。选取一菌数适中的巴氏牛乳样品进行重现性实验。将1 mL巴氏牛乳样品接种至加有9 mL的Bimedia002A培养基的测量瓶中作8个平行检测。各参数设置：临界值预设为5%M值；培养温度36℃；测量持续时间24 h。同时，为了避免样液中营养物质分解出离子而影响测量结果，将灭菌后的样品作基线，结合基线漂移情况确定最低可能的临界M值。

（3）标准曲线和回归方程的建立。直接吸取1 mL系列巴氏牛乳样品分别接种至已加有9 mL的Bime⁃dia002A培养基的测量瓶中，于Bactrac培养箱中36℃培养24 h，记录样品到达临界值的阻抗检测时间(IDT)。同时把样品按国标法进行平板菌落计数。以菌落总数的对数值为纵坐标，对应的IDT值为横坐标，将数据输入系统自带的数据处理软件中即可得到标准曲线和回归方程。

2 结果与讨论

2.1临界值的确定

由图1可知，巴氏牛乳样品在5%M具有良好的重现性，其阴性样品(基线)在24 h内最大漂移值为M＝1.3%（图2）。M值的确定主要遵循三个原则：高于基线最大漂移值、重现性良好及尽量减少检测时间。因考虑到巴氏牛乳样品的基质较复杂，会有一定的基线漂移，故确定5%M作为临界值。

图1 M值重现性

图2 基线

2.2标准曲线的建立和评价

基于统计学原因，要建立一条标准曲线，至少应该做30个测试，理想是做50～80个测试以上，且菌落数的分布应至少有4个稀释梯度，覆盖通常的可能范围。本实验在不同时期选取市售5大品牌共135个不同细菌浓度的巴氏杀菌牛乳样品进行检测，得到了菌落数对数值与IDT的标准曲线及其回归方程，如图3所示。建立标准曲线的细菌污染范围覆盖了巴氏牛乳中菌落总数允许的限量值，数量范围为10～108mL-1，且在标准曲线上分布均匀。

图3 巴氏杀菌牛乳菌落总数标准曲线

由图3可以看出，标准曲线的回归方程为y=-0.5923x+9.4172，其相关系数r=-0.9907，离差Syx=0.263。一般认为，r值应该≤-0.85，相关系数越接近理想值-1，阻抗检测与参照方法的关系越精确。而离差Syx（在取对数单位给出）应该至少小于0.5（对数值）单位。由此可见，本研究建立的标准曲线的相关关系非常显著，可信度高，完全满足用于巴氏杀菌牛乳中菌落总数快速检测的要求。

2.3电阻抗法的方法学研究

2.3.1 梯度分离结果

用于建立标准曲线的巴氏牛乳样品本身应对电阻抗检测结果无干扰。可分别选取各品牌的高菌落数的巴氏牛乳样品用UHT牛乳进行梯度稀释，检验各个梯度之间的曲线分离情况。一般要求各个梯度间的时间差要大于0.7 h，如果梯度间时间差很小或者没有，那就说明样品中有不明物质在干扰检测结果，有可能是抗生素或其他药物，或是防腐剂。由图4可以看出，样品的各个梯度间的时间差均大于0.7 h，对电阻抗检测结果无影响。

图4 巴氏杀菌牛乳样品的梯度分离结果

2.3.2 检测限的确定

2.3.2.1 检测上限的确定

可根据电阻抗法的理论检测上限确定为107mL-1。因为当微生物进入对数期，其浓度达到106～107mL-1时，测量曲线就达到了拐点附近，而高菌数的样品有可能在保温1 h期间就已经进入了对数期。当微生物浓度分别为107，108以及109mL-1时，达到曲线拐点处的检测时间没有区别。在实际样品中，一般也很少有大于107mL-1的样品，且巴氏杀菌牛乳中菌落总数允许的最大限量值为105mL-1，完全能满足实际样品分析的要求。

2.3.2.2 检测下限的确定

由于巴氏杀菌牛乳样品在进行电阻抗法检测时无需稀释，因此理论检测下限为1 mL-1，则可信检测下限应可确定为10 mL-1。取巴士牛乳样品用UHT牛乳进行梯度稀释，直至样品的含菌量不超过10 mL-1，将同一样品分别用阻抗法和国标法同时进行检测，结果如表1所示。比较发现，当样品含菌量不超过10 mL-1时，电阻抗法所得检测结果与国标法的相去甚远（P＜0.05）；而当样品含菌量大于10 mL-1时，两种方法所得的检测结果则无显著性差异（P＞0.05）。其主要原因一是因为巴氏杀菌牛乳中的细菌为混合菌群，各种细菌对阻抗的影响不同，当所含菌落数很少（不超过10 mL-1）时，细菌的种类及其对阻抗的影响具有很大的不确定性；另外当含菌量少时，样品取样时也存在较大的误差。由此可确定，电阻抗法的可信检测限为10～107mL-1。

表1 电阻抗法检测下限的确定

2.3.3 不同酸度样品的适用性实验结果

根据GB 19645-2010《食品安全国家标准巴氏杀菌乳》，牛乳的酸度范围为12～18°T。通过测定发现，市售的巴氏牛乳样品的酸度一般在12～14°T之间。为验证标准曲线对不同酸度样品是否均具有广泛适用性，可取适量的柠檬酸钠溶液调节样品酸度，使其在12～18°T范围内，同时进行电阻抗法检测，结果（均为算术平均值）如表2所示。经统计学分析，P＞0.05，结果无显著差异。可见，对于不同酸度的巴氏牛乳样品，标准曲线均适用。

2.4巴氏牛乳样品的评价标准

根据GB 19645-2010《食品安全国家标准巴氏杀菌乳》，巴氏牛乳菌落总数的限量指标为：n=5，c=2， m=50 000 mL-1，M=100 000 mL-1[1]。将警戒值50 000 mL-1和临界值100 000 mL-1分别代入标准曲线方程y=-0.5923x+9.4172，得到相对应的IDT分别为7.96 h和7.46 h。BacTrac软件据此可将检测结果分为三类：红代表阳性，表示样品不合格；黄代表怀疑，表示样品不能确定是否合格；绿代表阴性，表示样品合格（如表3所示）。由此可以快速、直观的对巴氏牛乳样品进行评价，最快7.46 h内即可判定样品是否合格。

表2 不同酸度样品的电阻抗法检测结果

表3 巴氏杀菌牛乳样品的评价标准

2.5电阻抗法检测巴氏牛乳样品的结果

取市售的5个品牌的样品（根据GB 19645-2010[1]，每份样品采集5瓶），分别用电阻抗法和国标方法进行检测，结果如表4（1-1～5-5）所示。因样品均合格，选取其中两个品牌的样品置于保存条件下自然增殖，再进行检测，结果如表4（6-1～7-5）所示。由此可见，两种方法所得的菌落总数结果无显著性差异（P＞0.05），样品评价结果完全一致。因此，电阻抗法是可以替代国标法对巴士牛乳样品进行检测的。

3 结论

本研究建立了电阻抗法快速测定巴氏杀菌牛乳中菌落总数的方法。所建立的曲线方程y=-0.5923x +9.4172，其相关系数r=-0.9907，非常接近理想值-1，可信度高；其可信检测限为10～107mL-1，完全满足食品安全国家标准的要求；设立的样品评价标准可以快速、直观的对巴氏牛乳样品进行评价，最快7.46 h内即可判定样品是否合格，大大缩短了检测周期。与国标法相比，电阻抗法简便快速、灵敏度高，又准确可靠，且适用于不同时期、不同来源、不同酸度的产品，具有广泛的适用性和实用性。为使标准曲线更具代表性，在日后的检验过程中仍应不断完善标准曲线，并定期进行校准，最大化的确保实验结果的准确可靠。巴氏杀菌羊乳因其细菌谱及加工工艺不同，并不适用于本方法，有待于进一步的探索和研究。

表4 巴氏杀菌乳样品菌落总数的检测结果

[1]中华人民共和国卫生部.GB 19645-2010.食品安全国家标准巴氏杀菌乳[S].北京：中国标准出版社，2010.

[2]中华人民共和国卫生部.GB 4789.2-2010.食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定[S].北京：中国标准出版社，2010.

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Application research in rapid detection of aerobic plate count in pasteurized cow’s milk by impedance method

DU Hanchun1,YE Kaifu1,LIU Shaogang2,HUANG Daoping1,TAN Xuecai2
(1.Guangxi Center for Analysis and Test Research,Nanning 530022,China；2.School of Chemistry and Chemical Engi⁃neering of Guangxi University for Nationalities,Nanning 530008,China)

A method for rapid detection of aerobic plate count in pasteurized cow’s milk by impedance method was established.The follow⁃ing relationship between the germ count and the impedance detection time(t)was determined for the calibration equation:y=-0.5923 t+ 9.4172,r=-0.9907,with high reliability,and the authentic detection threshold was 10～107mL-1,fully meet the requirements of the national food safety standard.The establishment of the sample evaluation criteria could be fast,intuitive evaluation ofthe milk samples,the fastest 7.46 h could determine whether the sample is qualified,greatly shorten the detection time.Compared with the nationalstandard method,the meth⁃od was simple,rapid,sensitive,accurate and reliable,and could be used in different periods,sources and acidity of the product,with a wide range ofapplicability and practicality.

impedance method;pasteurized cow’s milk;aerobic plate count

TS252.7

A

1001-2230（2017）04-0056-03

2016-10-24

广西直属公益性科研院所基本科研业务费专项项目(2011AC Z03)；广西自然科学基金项目(2013GXNSFBA019048)；广西科学研究与技术开发计划项目(桂科能14123006-24)；国家自然科学基金项目(21367004、21667005)。

杜寒春（1980-），女，高级工程师，研究方向为食品质量安全与检测。

谭学才