小体积液液萃取-GC/MS/MS法检验血中非那西丁

朱 昱杨 亮宋 辉

（1 中国刑事警察学院法化学系 辽宁 沈阳 110035；2 成都市公安局青羊区分局 四川 成都 610013）

小体积液液萃取-GC/MS/MS法检验血中非那西丁

朱 昱1杨 亮2宋 辉1

（1 中国刑事警察学院法化学系 辽宁 沈阳 110035；2 成都市公安局青羊区分局 四川 成都 610013）

建立血中非那西丁的小体积液液萃取-GC/MS/MS分析检验方法。血样中的非那西丁用小体积的环己烷萃取后，采用GC/MS/MS方法进行定性和定量分析。方法的样品萃取率为83.2%，检出限（LOD）为11.5ng/mL，定量限（LOQ）为38.5ng/mL，RSD为5.6%；平均相对回收率为98.9%。所建立的方法集分析物的提取和富集于一体，简便、快速、准确、灵敏，专属性强，为中毒案件中血中非那西丁的检验提供了可靠的方法。

非那西丁 气相色谱/质谱/质谱联用 血

1 引言

非那西丁属乙酰苯胺类解热镇痛剂，通常与其他药物配成复方制剂，是去痛片和消炎痛的组分之一。此外，非那西丁还作为毒品添加成分。近年来，服用去痛片自杀和去痛片过量服用造成用药者中毒的案件时有发生。非那西丁是去痛片的主要成分之一，在此类中毒案件中，常需要进行中毒者血中非那西丁的检测。

目前，血样中非那西丁的GC/MS法分析，国外主要采用衍生化-GC/CIMS分析方法[1-2]分析血浆中的非那西丁，操作较为复杂；国内GC/MS法检测血中非那西丁曾有报道采用总离子流一级质谱定性分析和选择离子（SIM）扫描外标法定量分析血中去痛片成分[3]，或采用七氟丁酰氯（HFBC）衍生化-GC/MS/MS法分析血中非那西丁[4]。本论文在借鉴国内外相关研究报道的基础上，研究建立了血中非那西丁的小体积液液萃取-GC/MS/MS分析方法。所建立的方法集分析物的提取和富集于一体，简便、快速、准确、灵敏，专属性强，满足非那西丁中毒血样检验鉴定的要求。

2 实验部分

2.1 试剂

非那西丁标准溶液：精确称取非那西丁(对照品，购自国家标准物质中心)，用甲醇配制成1.0mg/mL溶液。

内标标准溶液：精确称取SKF525A（购自Sigma公司，纯度≥95.0%），用甲醇配制成1.0mg/mL溶液。

pH10.8碳酸盐缓冲溶液：称取无水碳酸钠53.0g，碳酸氢钠42.0g，加水定容至500mL。

环己烷、氯化钠，均为分析纯。

空白血为近期未服药的健康人血。

2.2 仪器及条件

Thermo-Finnigan PolarisQ气相色谱/质谱联用仪。

GC条件：HP-5ms 熔融石英毛细管色谱柱（30m×0.25mm i.d. ×0.25μm），柱温：初始温度60℃，保持1min，升温速率20℃/min，至280℃恒温10min；气化温度280℃；载气：He，流量1min/mL；不分流进样。

MS条件：EI电离源，电子束能量70eV，离子源温度200℃；AGC自动增益控制，倍增器电压1350V；传输线温度280℃；一级质谱和二级质谱SRM全扫描方式检测（具体条件见下表）。

2.3 实验方法

取血样5mL，加入内标SKF525A标准溶液5μL，混匀；加入1.5g氯化钠至饱和，再加入1mL的pH10.8缓冲溶液，涡旋1min；加0.5mL环己烷，涡旋1min，振荡混匀，10000r/min离心3min，取上层有机相1μL进样，按2.2仪器条件进行GC/MS/MS分析，测定非那西丁和内标的二级质谱总离子流（TIC）色谱和质谱。根据特征母离子的二级质谱特征离子及其质量色谱的保留时间进行定性分析，根据二级质谱SRM色谱峰面积采用内标曲线法进行定量分析。

3 结果与讨论

3.1 总离子流色谱（TIC）和质谱

3.1.1 非那西丁和内标SKF525A的一级质谱MS1和二级质谱MS2

取非那西丁和内标SKF525A标准溶液，按2.2仪器条件进行GC/MS和GC/MS/MS分析，采集总离子流色谱、一级质谱（MS1）和二级质谱（MS2，母离子为一级质谱的基峰）。非那西丁和内标SKF525A的TIC色谱峰保留时间（tR）分别为8.99min和12.08min。其MS1和MS2质谱如图1、图2所示，MS2质谱特征子离子如下表所示。

表 一级质谱和二级质谱SRM全扫描检测条件和特征离子

3.1.2 空白添加血样的GC/MS/MS总离子流色谱

取空白血样5mL，添加非那西丁标准溶液和SKF525A标准溶液各5μL，按2.3项实验方法进行样品处理和GC/MS/MS分析，其SRM二级质谱的TIC色谱如图3所示。可见非那西丁和内标SKF525A的GC/ MS/MS色谱峰分离良好且互不干扰。

图1 非那西丁和内标的MS1质谱

图2 非那西丁和内标的MS2质谱

3.2 内标物的选择

对于GC/MS/MS分析来说，较为理想的内标应是分析物的氘代物。因此，国外已有的GC/MS法定量分析血中非那西丁的文献中均采用氘代物做内标。但国内氘代物来源较困难，且价格昂贵，分析成本较高。因此，本文选择国内公安毒物分析领域中定量分析碱性药毒物常用的SKF525A做内标。

图3 空白添加血样的SRM二级质谱TIC色谱

3.3 气相色谱/质谱分析方式的选择

在GC/MS一级质谱全扫描方式检测总离子流色谱中，血样基体的响应信号高，内源性杂质干扰较大，非那西丁色谱峰的信噪比较低，导致灵敏度降低，虽然采用选择离子检测（SIM）方式，可降低背景噪声，提高灵敏度，但会降低质谱的特异性，使定性的准确性和可靠性下降。而在GC/MS/ MS总离子流色谱中，采用二级质谱的选择反应监测（SRM）检测方式，可最大程度上消除了检材基体和内源性杂质的干扰，显著提高了检测灵敏度；同时由于SRM子母离子相互配合印证，避免了一级质谱SIM检测方式的定性特异性差、抗干扰能力不强等缺点。因此，本文利用SRM监测技术，以非那西丁一级质谱的基峰特征离子作为母离子，根据其二级质谱的特征子离子进行定性分析；利用二级质谱的SRM色谱峰面积进行定量分析。

3.4 萃取方法、萃取溶剂和萃取率

本文采用小体积液-液萃取方法对血中的非那西丁进行提取。在萃取时，采用0.5mL环己烷萃取5mL血中的非那西丁，使非那西丁由大体积（5mL）的水基质血样中转移到小体积（0.5mL）的环己烷有机相中，集分析物的提取与富集于一体，不需对萃取液进行浓缩。既简化了操作，又避免了萃取液浓缩所造成的分析物的损失。

实验中对乙醚、环己烷、苯、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯作为萃取溶剂分别进行了考察。结果表明乙酸乙酯、三氯甲烷的萃取率较高，分别为89.1%和88.3%，乙醚、环己烷、苯、二氯甲烷的萃取率接近分别为83.1%、83.2%、84.1%和83.8%，但乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷、苯萃取时较易乳化，乙醚则挥发性太强，萃取时由于溶剂体积小而容易挥干而分取困难，另外三氯甲烷和二氯甲烷萃取液位于水基质血样下层，不便分取。因此，选择环己烷作为小体积萃取的溶剂。

实验中在血样中加入氯化钠至饱和，使水基质血样和萃取剂有机相之间的比重差加大，有效地消除了萃取过程中的乳化现象。

在空白血中加入1.0μg/mL的非那西丁，进行萃取率测定试验，根据经萃取和未经萃取样品所测得的非那西丁与内标的二级质谱SRM色谱峰面积比，计算非那西丁萃取率。结果测得非那西丁的平均萃取率E%=均值±SD=83.2%±5.5%（n=5）。

3.5 检出限（LOD）和定量限（LOQ）

本方法以非那西丁GC/MS/MS色谱峰信噪比为3时的信号值所对应的血样中非那西丁浓度为检出限（limit of detection，LOD），以非那西丁色谱峰信噪比为10时的信号值所对应的非那西丁浓度为定量限（limit of quantitation，LOQ）。 结果测得血样中非那西丁的LOD为11.5ng/mL，LOQ为38.5ng/mL。

3.6 内标工作曲线

取5mL空白血若干份，制备不同浓度（0.05、0.25、1.0、5.0、10和50μg/mL）的非那西丁空白血添加系列，分别加内标SKF525A各1μg，按2.3方法进行GC/MS/MS分析。以非那西丁的添加浓度（X，μg/mL）为横坐标，非那西丁与内标SKF525A的二级质谱SRM色谱峰面积比（Y）为纵坐标，进行线性回归，得内标工作曲线方程为y=0.3559x-0.0084，相关系数r=0.9993，呈良好的线性关系，线性范围0.05~50μg/mL。

3.7 准确性和精密度

取空白血制备非那西丁浓度为1.0μg/mL的添加血样，进行标准加入回收实验，测定相对回收率，计算平均相对回收率和RSD（n=5），结果血中非那西丁的平均相对回收率为98.9%，平均RSD为5.6%。

3.8 方法的专属性

取空白血样，按2.3实验方法进行样品处理和GC/MS/MS分析。结果表明，空白血的内源性杂质不干扰分析物的测定。

4 服药自愿者血样检测

一健康男性，25岁，口服治疗量去痛片2小时后采集血液，用本文方法测定血样中非那西丁浓度为3.1μg/mL。表明本方法满足司法检验鉴定的要求。

[1]Murray S, Boobis AR. Combined assay for phenacetin and paracetamol in plasma using capillary column gas chromatography-negative-ion mass spectrometry[J]. J. Chromatogr. A,1991(2):341-350.

[2]Garland WA, Hsiao KC, Pantuck EJ,et al. Quantitative determination of phenacetin and its metabolite acetaminophen by GLC-chemical ionization mass spectrometry[J]. J.Pharm. Sci.,1977(3): 340-344.

[3]王皓玉,等.血中去痛片有效成分的分析[J].山西医科大学学报,2007(6): 518-522.

[4]杨亮,等.血中非那西丁的GC/MS检测[J].广东化工,2014(24):108-110.

（责任编辑：孟凡骞）

R991；O657.63

A

2095-7939(2017)02-0100-03

10.14060/j.issn.2095-7939.2017.02.020

2016-11-29

朱昱（1964-），男，辽宁沈阳人，中国刑事警察学院法化学系教授，主要从事毒物毒品分析研究。