神经调节蛋白1在食管癌中的表达及临床意义*

王友伢，宁志丰，白育庭，**

(1.武汉大学中南医院胸心外科，湖北 武汉 430071；2.湖北科技学院)



神经调节蛋白1在食管癌中的表达及临床意义*

王友伢1，宁志丰2，白育庭1，2**

(1.武汉大学中南医院胸心外科，湖北 武汉 430071；2.湖北科技学院)

目的 探讨神经调节蛋白1(neureglin1，NRG1)在食管癌组织中的表达，并分析其与临床病理特征之间的关系。方法 采用免疫印迹(Western Blot)、实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time PCR)检测食管癌及正常食管组织中NRG1在蛋白水平及核酸水平的表达，采用免疫组化(ICH)SP法检测NRG1在食管癌组织中的表达强度，并分析NRG1的表达和临床特征之间的关系。结果 在蛋白水平，NRG1在食管癌组织中的表达均低于正常食管组织(P<0.05)，在核酸水平也显示该趋势(P<0.05)，且表达与患者的性别和肿瘤分化程度相关(P均<0.05)，与年龄、吸烟、饮酒、淋巴结转移、TNM分期无相关性(P>0.05)。结论 食管癌的发生及恶性程度可能与NRG1的表达相关，NRG1有可能成为食管癌治疗的新的有效靶点。

食管癌；神经调节蛋白1

食管癌在我国发生率高，组织学上以鳞状细胞癌多见，食管鳞癌已成为我国卫生部确定的十大特色肿瘤之一[1]，临床上多采用外科手术治疗[2]，但由于食管癌的早期症状多不明显，多数患者就诊时病情已达中晚期，导致预后较差，手术后需要辅助其他治疗[3-4]。相关研究发现食管癌组织中存在多条信号转导通路的异常激活，但目前尚无作用于食管癌的有效靶向治疗药物[3]，因此寻求有效的治疗靶点可能对于食管癌的治疗具有重要的意义。国外相关研究显示神经调节蛋白1(NRG1)与多种肿瘤的发生发展密切相关，且其发生作用的过程中导致多种与肿瘤相关的信号通路分子改变[5]。NRG1在食管中的作尚未见具体研究，本实验意在研究NRG1在食管癌中的表达，同时探讨其表达量与患者的临床病理特征之间的关系，为食管癌的诊疗提供新的有价值的思路。

1 材料与方法

1．1 实验材料 收集武汉大学中南医院2015年5月至2016年1月胸心外科行手术切除的食管癌组织标本及对应的正常组织(距癌组织5cm以上，术后病检均未发现癌细胞)30例用于免疫印迹(Western Blot)及聚合酶链式反应(PCR)实验，2015年1月至2016年2月行石蜡包埋的食管癌组织64例用于免疫组化实验。提供组织的所有患者均被证实无心脏、神经系统疾病，无其他器官肿瘤，术前均未经任何放疗或化疗；所收集的癌组织术后经病理证实均为食管鳞癌。收集所有提供用于免疫组化实验标本的患者的临床信息，包括年龄、性别、吸烟史、饮酒史、肿瘤分化程度、淋巴结转移情况及TNM分期。所有标本收集术前均获得患者同意及武汉大学中南医院医学伦理委员会批准。NRG1兔抗人多克隆抗体购买自abnove公司。

1.2 Western Blot 将低温冻存的新鲜食管癌组织及配对的正常组织标本取出后经TBS充分清洗并剪碎置入碾钵中，每1g组织中加入500μL组织裂解液(RIPA)及10μL的蛋白酶抑制剂(PMSF)，然后在冰浴上充分碾磨，转移到EP管中。以12000 r/min，4℃离心15min，转移上清到到新的EP管中，加入125μL上样缓冲液(5×)，100℃煮沸10min后上样。80 V的电压电泳至溴酚蓝进入分离胶(10%)时改变电压至120V，待溴酚蓝至胶底时，停止电泳。将凝胶中的目的蛋白NRG1及内参蛋白β-actin电转至PVDF膜上。使用5%的脱脂奶粉(含0.05%Tween-20的TBST缓冲液配制)在室温下封闭2h；NRG1兔抗人多克隆抗体(1∶1000稀释)及β-actin兔抗人多克隆抗体(1∶1000稀释)4℃下摇床孵育过夜，TBST漂洗4×10min，羊抗兔IgG抗体(1∶20000)室温下孵育2h，TBST漂洗4×10min，ECL检测液显色并曝光，使用quantity one软件对条带进行半定量分析。以NRG1蛋白条带的光密度值与β-actin蛋白条带光密度值之比作为蛋白相对表达量。

1.3 Real-time qPCR 分别取冻存的新鲜食管癌及正常食管组织，以Trizol(Invitrogen)、三氯甲烷、异丙醇、乙醇依次提取组织中的总RNA，所得RNA溶于DEPC水中，紫外分光光度计测定RNA的浓度及纯度，用所有备用的RNA的A260/A280均在1.90～2.02之间，以逆转录试剂盒(Takara)将mRNA逆转录成cDNA,PCR引物序列为NRG1(forward:5′-AGTCCTTCGGTGTGAAACCAG-3′,reverse:5′-TGCGAAGTTCTGACTTCCCTG-3′),内参β-actin(F:5′-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3′,R:5′-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3′),反应体系为2×SYBR Premix ExTaq 10μL，上下游引物各1μL，cDNA1μL，无酶水7μL，总体积为20μL，反应条件为95℃ 5min预变形，95℃ 30s变性，57℃ 30s退火，72℃ 45s延伸，共40个循环，最后72℃ 10min终延伸；反应结束后，由电脑自动设置阈值，并记录相应的CT值。本研究采用2-ΔΔCt,相对定量法比较目的基因在不同组织中的表达水平。

1.4 免疫组织化学染色 所有标本均用4%多聚甲醛常温固定24h～72h，石蜡包埋，制成5mm的切片。石蜡切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水后，0.3%H2O2甲醇溶液中室温孵育30min，消除内源性过氧化物酶活性，蒸馏水清洗，微波法抗原修复、磷酸盐缓冲液(PBs)浸泡5min，1∶10山羊血清封闭液室温孵育10min，加NRG1兔抗人多克隆抗体(1∶100稀释)4℃过夜，生物素标记的二抗和辣根过氧化物酶标记链霉菌卵白素37℃各30 min，二氨基联苯胺(DAB)显色，水洗，苏木素复染，梯度乙醇脱水、二甲苯透明后，树胶封片，在光学显微镜下观察全片，在400倍的高倍镜下观察并从两方面对切片进行评分，根据细胞染色强度计分：无着色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；根据阳性细胞数计分：1%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%及以上为4分。两项评分相乘为最终结果：0～2分以下为阴性(-)，3～4分为弱阳性(+)，6～8分为中阳性(++)，9分及以上为强阳性(+++)。

1.5 统计学方法 应用SPSS 17．0统计软件分析。比较两种组织中NRG1在蛋白水平的表达采用配对t检验，在核酸水平的表达采用独立样本t检验，分析NRG1的表达与临床特征之间的关系采用Fisher’s精确χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 NRG1在食管癌及食管正常组织中的表达 在蛋白水平，NRG1在食管癌组织及对应的正常食管组织中均可见表达，并且在癌组织中表达低于在正常组织中的表达(P=0.004<0.05)，见图1(封三)，该种蛋白主要表达于细胞核及细胞膜中，在一些细胞的细胞质中也可见其表达，见图2(封三)。在核酸水平，NRG1的表达也表现在癌组织中低于正常组织(P=0.032<0.05)。

2.2 NRG1的表达强度与临床病理参数间的关系 NRG1在癌组织中的表达与患者的性别相关(P=0.047<0.05)，并且与肿瘤分化程度显著相关(P=0.002<0.05)，而与患者的年龄、吸烟史、饮酒史、淋巴结转移情况及肿瘤的TNM分期无明显相关性(P>0.05)。见表1。

表1 NRG1的表达与临床病理各参数之间的关系(n=64)

3 讨 论

食管癌是我国常见的恶性肿瘤，发病率高，占我国恶性肿瘤死因的第4位[4]，2012年全球新发食管癌患者约为455800例，死亡约400200[6]。食管癌的发病因素很多，目前认为吸烟、饮酒、各类慢性刺激及环境因素是中国食管鳞癌发病的主要原因[1]。临床上，食管癌主要采用外科手术治疗，但因为多数食管癌患者早期无明显症状，就诊时病情已达中晚期，单纯手术治疗效果不佳，为提高术后生存质量，常常需要加行其他辅助治疗[3-4]。相关研究发现食管癌组织中存在多条信号转导通路的异常激活，但目前的p53、Ki-67等食管癌治疗靶点的有效性存在争议性[3]，因此寻求有效的治疗靶点可能对于食管癌的治疗具有重要的意义。

NRG1最早于1992年在神经科学研究领域中被发现，该基因位于染色体8P12上，含有1.4Mb个碱基序列[7]，其编码的蛋白NRG1因在不同的实验室中分离纯化而具有不同的名称，如人神经调节蛋白(heregulin，HRG)、神经分化因子(neu differentiation factor，NDF)、胶质生长因子(gial growth factor，GGF)及乙酰胆碱受体活性诱导因子(acetylcholine receptor inducing activity，ARIA)[8]。通过转录过程中启动不同的转录启动子以及翻译过程中选择性的mRNA剪切方式，其可编码至少15种不同的跨膜蛋白结构[7]，即NRG1有多种亚型结构。在结构上，NRG1由6种结构域组成：氨基端区域、免疫球蛋白样结构域、EGF样结构域、近膜序列、跨膜序列和细胞质结构域，大多数NRG1亚型都是以无活性的前体形式(proNRG1)锚定在细胞膜上的，当EGF样结构域的近C端被水解后，形成可溶性的成熟的NRG1才具有生物活性[7，9]，即EGF样结构域在NRG1发挥功能的过程中起着重要作用。在功能上，NRG1为一类重要的信号蛋白，其作为配体通过EGF样结构域结合于受体酪氨酸激酶家族(ErbBs)成员，一方面可以使ERBBs活化并形成异源二聚体，导致下游一系列复杂的信号转导途径如丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)等通路被启动[10-12]，从而发挥信号转导的生物学效应；另一方面NRG1可以迅速被内化，运输到细胞核中，作为核生长因子，参与细胞周期、分化、恶性形成相关的致癌基因c-myc的活化并启动其转录过程，发挥有丝分裂原、诱导分化剂、转化剂的效应[13]。在上皮源性恶性肿瘤中常见8号染色体短臂结构的改变，NRG1基因位于该部位常常被累及[14-15]。国内外已有多项研究证实NRG1在多种恶性肿瘤中异常表达[16]，并参与肿瘤的增殖生长、分化、转移、微血管生成及微环境改变等过[17-21]。但其在食管癌中尚未见具体研究。

本实验研究NRG1在食管癌中的表达并对其与食管癌患者临床特征的相关性进行分析。本研究通过Western Blot方案证实NRG1在在蛋白水平既表达于食管癌组织，也表达于正常的食管组织中，且在癌组织中表达相对较低，通过Real-time qPCR方案证实NRG1在核酸水平的表达同样符合该观点。通过免疫组化的研究显示NRG1在食管癌中的表达与患者的性别和肿瘤分化程度显著相关，而与患者的年龄、吸烟史、饮酒史、淋巴结转移及肿瘤TNM分期无明显相关性。这些研究结果提示NRG1在肿瘤的发生发展过程中起一定的作用，但本实验未对NRG1发挥上述作用的机制、NRG1对食管癌细胞的生物学行为得影响及对食管癌患者的预后等方面做研究。

综上所述，NRG1在食管癌的发生发展中起一定的作用，尚不能确定其是否可以作为一种抑癌基因及其发挥的作用，即NRG1能否作为食管癌诊断和治疗的新的特异性分子指标还需更深研究。

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The Expression of NRG1 in Esophageal Carcinoma and its Clinical Significance

WANG You-ya,NING Zhi-feng,BAI Yu-ting

(DepartmentofCardiothoracicSurgery,ZhongnanHospital,WuhanUniversity,WuhanHubei430071,China)

Objective To study the expression and clinical significance of neureglin1(NRG1)in esophageal carcinoma tissues. Methods The expression of NRG1 at the protein levels 1 in esophageal cancer tissue and normal esophageal tissue was detected by Western blot and at nucleic acid level by real-time quantity PCR.The relationship between the expression of NRG1 in esophageal carcinoma and clinical characteristics by Immunohistochemistry(IHC) was also analyzed.Results The expression of NRG1 at the protein level in esophageal cancer was significantly lower than both normal esophageal tissue (P<0.05) and at the nucleic acid level(P<0.05),and its expression was gender-related differentiation,but not significantly associated with with age,smoking and drinking history,lymph node metastasis and TNM stage.Conclusion The occurrence and malignancy degree of esophageal cancer may be associated with the expression of NRG1,and NRG1 may serve as a new effective target of esophageal cancer treatment.

Esophageal carcinoma;NRG1

湖北省自然科学基金重点项目(2011CDA064)

R735.1

A

2095-4646(2017)02-0100-04

10.16751/j.cnki.2095-4646.2017.02.0100

2017-01-06)

**通讯作者，E-mail：xybyt0628@163．com