超声波辅助法提取葡萄籽中原花青素工艺

邓寒霜，曹华，李筱玲

（商洛学院生物医药与食品工程学院，陕西商洛 726000）

葡萄，葡萄属（Vitis）藤本植物，约 60种，原产于亚洲北部，目前广泛栽培于地中海地区。在我国长江流域以北各地葡萄种植面积和产量都非常高，国内主产区在新疆，约占全国栽培面积的30%[1]。葡萄主要用于酿造葡萄酒、白兰地和甜露酒等，也可鲜吃或制成干果食用，如葡萄干、淡黄葡萄干和无核小葡萄干等。随着葡萄产量的增加以及对葡萄的使用，在葡萄制品的生产加工过程中产生了许多废弃物，如葡萄籽、葡萄皮、葡萄渣等。其中葡萄籽主要为葡萄汁和葡萄酒加工等产业的废弃物，约占整个葡萄重量的5%～7%[2]。我国葡萄资源丰富，据统计2013年全国葡萄总产量高达1121.20万吨[3]，据此计算，每年葡萄籽的产量高达数十万吨。相关研究表明葡萄籽里包含葡萄籽油、蛋白质、原花青素等物质，这些物质拥有较高的营养价值，还具有相当好的保健功能，在食品、药品、保健品等行业都可被安全使用[4]。早期对于葡萄籽的研究多集中在葡萄籽油[5]和多糖[6]的范围内。近年来，人们从葡萄籽和皮中分离出了具有较强抗氧化和清除自由基能力的功能因子——原花青素，其抗自由基的氧化能力是维生素E的50倍、维生素C的20倍[7]。目前，大量的葡萄籽资源被当作废弃物处理，或者直接做成简单的饲料卖给农户，易造成环境污染，降低天然资源的生物利用度，也不符合创新、协调、绿色、开放、共享的发展理念。为了提高葡萄籽的生物利用度，本文对其中原花青素的提取工艺进行探讨。

1 材料与方法

1.1 实验材料

葡萄籽，采自市售葡萄，干燥至恒重后粉碎，过45目筛，装袋备用[8]。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的制作

精密称取原花青素标准品20 mg，用无水乙醇溶解并定容至50 mL，得标准品储备液。精确吸取上述储备液 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分别加入2.0 mL 30 g·L-1香草醛甲醇溶液及2.0 mL 30%H2SO4甲醇溶液，以无水乙醇定容至10 mL，混均，在避光条件下于30℃水浴反应20 min，以浓度为0的标准液为空白，在500 nm处测定吸光度[9]。以原花青素标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得标准曲线方程y=2.2592x+0.1022，R2=0.9977。线性范围为0～0.24 mg·mL-1。

1.2.2 样品溶液处理

精密称取葡萄籽粉末1 g，置150 mL三角瓶中，按设定条件进行超声波辅助提取，离心，取上清液，残渣洗涤后沉淀，二次离心，合并两次上清液，定容至50 mL，得到样品溶液。取稀释5倍后的样品溶液1 mL，依照1.2.1的方法进行含量测定，计算原花青素提取率。

式中：C——样品原花青素浓度（mg·mL-1），V——提取液的体积（mL），n——稀释倍数，W——葡萄籽粉末样品重量（mg）。

1.2.3 单因素试验

1）乙醇浓度对葡萄籽原花青素提取率的影响

精密称取葡萄籽粉末1 g，固定料液比为1∶10，提取时间 10 min，分别在 40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇浓度下，提取2次，依照1.2.2的方法进行含量测定，计算原花青素提取率。

2）超声时间对葡萄籽原花青素提取率的影响

精密称取葡萄籽粉末1 g，固定乙醇浓度为80%，料液比 1∶10，分别超声处理 10、20、30、40、50、60 min，提取2次，依照1.2.2的方法进行含量测定，计算原花青素提取率。

3）料液比对葡萄籽原花青素提取率的影响

精密称取葡萄籽粉末1 g，固定乙醇浓度为80%，超声时间 20 min，分别以1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的料液比，提取2次，依照1.2.2的方法进行含量测定，计算原花青素提取率。

4）提取次数对葡萄籽原花青素提取率的影响

精密称取葡萄籽粉末1 g，固定乙醇浓度为80%，超声时间 20 min，料液比 1∶20，分别提取 1次、2次、3次，依照1.2.2的方法进行含量测定，计算原花青素提取率。

1.2.4 正交试验

因提取2次后样品中原花青素提取率增加不大，为提高工作效率，将提取次数固定为2，依据单因素试验结果，以提取率为考察指标，进行正交试验，确定最优提取工艺。正交试验因素水平设计见表1。

表1 正交实验因素水平表

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇浓度对葡萄籽原花青素提取率的影响

在实验中能观察到，随着乙醇浓度的增大，提取液的澄清度越来越好。同时，由图1可知，随着乙醇浓度增加，提取率有一个持续上升的过程。但当乙醇浓度大于80%后，原花青素提取率有所下降。分析原因可能是当乙醇浓度高于80%时，一些醇溶性杂质、色素和脂溶性强的成分溶出量增加，这些成分与原花青素争夺乙醇—水分子，使原花青素的溶出率下降，从而导致提取率降低。

图1 乙醇浓度对葡萄籽原花青素提取率的影响

2.1.2 超声时间对葡萄籽原花青素提取率的影响

由图2可知，当超声时间小于30 min时，随着时间的延长，葡萄籽原花青素提取率逐渐增加；当提取时间超过30 min后，提取率开始下降。分析原因可能是由于长时间的超声处理会导致原花青素的结构遭到破坏所致。考虑到超声处理30 min相对处理20 min时提取率只有略微增加，为提高工作效率，最优超声时间以20 min为宜。

图2 提取时间对葡萄籽原花青素提取率的影响

2.1.3 料液比对葡萄籽原花青素提取率的影响

由图3可知，随着溶剂用量的增加，葡萄籽原花青素提取率逐渐增加，当料液比超过1：20后，提取率已经趋于稳定。说明当料液比为1∶20时，原花青素已能充分溶出，再增加提取溶剂，提取率也不会有明显的增长，因此，料液比选择1∶20 为宜。

图3 料液比对葡萄籽原花青素提取率的影响

2.1.4 提取次数对葡萄籽原花青素提取率的影响

由图4可知，经过2次提取，大部分原花青素已充分溶出，为提取工作效率，在正交试验中不再对提取次数进行考察。

图4 提取次数对葡萄籽原花青素提取率的影响

2.2 葡萄籽原花青素提取率正交实验结果

由表2和表3分析可知，影响葡萄籽原花青素提取率的因素主次顺序为A＞B＞C，即乙醇浓度对原花青素提取率的影响最大，其次是提取时间，最后为料液比。由正交分析可得最佳工艺条件为：A2B2C3，即乙醇浓度为80%，提取时间为20 min，料液比为 1∶25。

表2 葡萄籽原花青素提取率正交实验方案及结果

表3 葡萄籽原花青素提取率的极差分析

2.3 葡萄籽中原花青素提取率验证试验结果

精密称取葡萄籽粉末5份，每份1 g，按正交试验所得最佳工艺条件，即乙醇浓度80%，提取时间 20 min，料液比 1：25，重复提取2次，依照1.2.2的方法测定含量，计算原花青素提取率。由表4可以得知，在最优条件下，葡萄籽中原花青素提取率平均值为4.45%，相对标准偏差（RSD）为1.25%，表明该优选工艺稳定可行。

表4 葡萄籽原花青素提取率的验证实验结果

3 结论与讨论

原花青素的提取方法有热回流提取法、微波辅助法、超声波辅助法、超声—微波协同提取技术、超临界流体提取法、酶提取法等[10-13]。传统的热回流提取法以及有机溶剂浸提法存在时间长、溶剂使用成本高，且能耗大、提取率低等问题。超声辅助提取法和微波辅助提取法等是近年来发展起来的新型提取技术，具有选择性高、耗时少、能耗低、溶剂耗量少、排污量少等优点，是目前天然产物提取的创新技术。

本文以葡萄籽原花青素提取率为指标，在单因素试验的基础上，采用正交试验对超声波辅助法提取葡萄籽中原花青素的工艺条件进行了研究。得到最优提取工艺为以80%的乙醇为溶剂，在料液比1：25条件下，超声提取时间20 min，在此条件下重复提取2次，葡萄籽原花青素平均提取率为4.45%。经5次验证实验表明，该工艺条件操作稳定、可行，有很好的重复性。据苏芳等[14]研究发现超声功率对提取结果影响不大，故本研究未考察该因素的影响情况，为了给葡萄籽原花青素的提取工艺研究提供更详实的数据支持，在后续的工作中有必要对其进行更系统的研究。

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[13]李筱玲,邓寒霜,吴瑞宁.超声法提取山茱萸果核酚工艺研究[J].商洛学院学报,2017,31(4)：62-65.

[14]苏芳,顾明广,冯献起.超声波辅助法提取葡萄籽中原花青素工艺的研究[J].中国酿造,2015,34(12)：113-116.