不同添加物对拟康木霉St-zn-9在土壤浸渍液中生长的影响

冯振宇,杨蕊,霍云凤,郎剑锋,石明旺

不同添加物对拟康木霉St-zn-9在土壤浸渍液中生长的影响

冯振宇,杨蕊,霍云凤,郎剑锋,石明旺

（河南科技学院资源与环境学院,河南新乡453003）

为明确添加物对木霉打破土壤抑菌能力的影响,以土壤浸渍液培养基为基础培养基,研究了不同添加物添加后木霉菌丝干质量和产孢量的变化.结果表明：不同添加物对木霉菌丝干质量和产孢量的影响不同,其中添加枣果煎汁、葡萄糖、尿素、磷酸二氢钾、马铃薯煎汁和玉米秸秆煎汁时菌丝干质量与产孢量均显著高于对照.组合培养以组合D（加入玉米秸秆煎汁和尿素）效果最佳,产孢量达到（14.17±0.38）×107个/mL.

木霉；营养物质；菌丝生长；产孢量

木霉是一类受到广泛关注的生防菌,其所需生长条件低,可产生大量的分生孢子和厚垣孢子,对多种植物病害具有生防作用,目前已有多种生防制剂问世,多为活的分生孢子制剂.但生防制剂在生产应用时极易受到环境条件的影响,如土壤的抑菌作用[1],农药或化肥对木霉的影响[2-3]等,导致木霉在田间定殖能力不佳,防效降低,影响田间推广与应用.许传坤等[1]发现通过在土壤中添加葡萄糖或糖蜜可以打破土壤的抑菌作用,但纯粹地添加葡萄糖或糖蜜成本较高,不利于田间的推广.秸秆还田是目前普遍采取的一种措施,如能利用田间剩余的大量秸秆和不同的营养物质共同作用来增加木霉在土壤中的定殖能力,对今后木霉生防制剂的推广和应用具有积极意义.本试验以土壤浸渍液培养基为基础培养基,以木霉的菌丝干质量和产孢量为指标,研究在基础培养基中添加不同营养物质后菌丝干质量和产孢量的变化,旨在为今后提高木霉生防效果及其生防制剂的制备奠定基础.

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试拟康木霉（Trichoderma pseudokoningii）St-zn-9菌株由河南科技学院植物病理实验室提供.

酵母浸膏（分析纯,上海邦景实业有限公司）,葡萄糖（分析纯,上海劲马实验设备有限公司）,尿素（分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司）,磷酸二氢钾（K2HPO4·3H2O）（分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司）.生物质炭,由河南科技学院资源与环境学院生态实验室提供；枣果（市售）；玉米秸秆和小麦秸秆,均取自河南科技学院实验田.土壤为壤土,上茬作物小麦,取耕作层10—15 cm的土壤,自然风干备用.

1.2 试验方法

1.2.1 培养基的配制木霉的活化用PDA培养基,配方为：马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,水1 000 mL.土壤浸渍液培养基参考孙晓棠等[4]的方法,取土样400 g,用蒸馏水振荡1 h,静置后过0.22μm微孔滤膜除菌,补足水至1 000 mL,自然pH.

1.2.2 不同煎汁的配制将秸秆和枣果分别粉碎,称取200 g,加1 000 mL蒸馏水煮1 h,静置30 min后用多层纱布过滤取上清.

1.2.3 种子培养液的制备木霉菌种活化后,接种到PDA培养基上,待其完全变绿后,用生理盐水冲洗平板表面,配制成孢子悬浮液,调节孢子浓度为107cfu/mL.

1.2.4 木霉液体培养在基础培养基中,分别加入酵母浸膏、生物质炭、尿素、葡萄糖、磷酸二氢钾各2 g,秸秆煎汁按20%的体积比加入,每瓶加2 mL木霉孢子悬浮液,重复3次,28℃、150 r/min振荡培养10 d后测菌丝干质量和产孢量,以基础土壤浸渍液培养基为对照.菌丝干质量测定方法：过滤收集菌丝,60℃烘干至恒质量,测菌丝干质量.产孢量计数采用血球计数板计数.

1.2.5 土壤浸渍液中添加不同营养物质对菌丝干质量和产孢量的影响根据田间实际需要和1.2.3的结果,在土壤浸渍液基础培养基上,进行如下组合试验：A,加入玉米秸秆煎汁和马铃薯煎汁；B,加入玉米秸秆煎汁和葡萄糖；C,加入玉米秸秆煎汁和磷酸二氢钾；D,加入玉米秸秆煎汁和尿素；E,加入玉米秸秆煎汁和枣果煎汁.以仅加入葡萄糖为相对对照CK.

1.3 数据处理

试验数据采用SPSS 16.0软件进行处理,用Duncan氏新复极差法进行多重比较.

2 结果与分析

2.1 营养物质对拟康木霉液体发酵后菌丝干质量与产孢量的影响添加不同营养物时拟康木霉菌丝干质量与产孢量见表1.

表1 添加不同营养物对拟康木霉菌丝干质量与产孢量的影响Tab.1 Effectofadding differentadditive on the mycelium dry weightand spore production of Trichoderma pseudokoningii

由表1可知,在土壤浸渍液培养基中添加不同营养物质后木霉菌丝干质量与产孢量不同.菌丝干质量方面,以添加枣果煎汁时的菌丝干质量最大,达到（1.86±0.12）g,接下来依次为葡萄糖（1.25±0.01）g、尿素（0.89±0.03）g、马铃薯煎汁（0.72±0.06）g、磷酸二氢钾（0.71±0.05）g、玉米秸秆煎汁（0.58±0.04）g,而生物质炭、酵母浸膏和小麦秸秆煎汁与对照相比无显著差异.木霉产孢量方面,以添加马铃薯煎汁时的产孢量最大,达到（4.58±0.05）×107个/mL,接下来依次为酵母浸膏（2.51±0.19）×107个/mL、磷酸氢二钾（1.70±0.04）×107个/mL、葡萄糖（1.64±0.06）×107个/mL、尿素（1.58±0.05）×107个/mL、玉米秸秆煎汁（0.78±0.02）×107个/mL与枣果煎汁（0.78±0.01）×107个/mL,与对照相比在0.05水平均达到显著差异,而小麦秸秆煎汁和生物质炭处理的产孢量与对照相比差异不显著.

2.2 不同添加物组合对拟康木霉菌丝干质量与产孢量的影响

根据2.1的试验结果,设定不同的添加物组合.不同组合对拟康木霉菌丝干质量与产孢量的影响见表2.

表2 不同组合对拟康木霉菌丝干质量与产孢量的影响Tab.2 Effectofadding differentcombination cultivation on the mycelium dry weightand spore production of Trichoderma pseudokoningii

由表2可知,组合E的菌丝干质量最大,达（1.83±0.04）g,组合A、B、C与D和对照相比无显著差异,说明加入玉米秸秆煎汁后同仅加入葡萄糖效果一样.产孢量方面,不同组合与对照相比均达到显著差异,其中以组合D的产孢量最高,达到（14.17±0.38）×107个/mL,接下来依次为组合A、B、C.组合E产孢量较少,仅为（0.67±0.02）×107个/mL.

3 结论与讨论

本试验中所用培养基为低营养的土壤浸渍液培养基,此培养基单独用于木霉的生长时,木霉菌丝干质量与产孢量均较低,分别为（0.36±0.01）g和（0.62±0.03）×107个/mL.但是当加入一些别的营养物质时,木霉在土壤浸渍液中的菌丝干质量与产孢量各有不同.菌丝干质量方面,枣果煎汁、葡萄糖、尿素、磷酸二氢钾、马铃薯煎汁与玉米秸秆煎汁和对照相比差异显著,而生物质炭、酵母浸膏和小麦秸秆煎汁与对照相比无显著差异.根据此试验结果,修正了基础培养基,在其中加入了玉米秸秆煎汁,然后分别再加入其余添加物,结果表明,组合E的菌丝干质量最大,达（1.83±0.04）g,组合A、B、C与D和对照相比无显著差异,说明不同组合加入后与仅加入葡萄糖相比效果相当.产孢量方面,不同组合与对照相比均达到显著差异,其中以组合D（加入玉米秸秆煎汁和尿素）的产孢量最高,达到（14.17±0.38）×107个/mL,因此,在田间同时添加玉米秸秆和尿素有利于木霉的增殖.接下来依次为组合A、B、C.组合E产孢量较少,仅为（0.67±0.02）×107个/mL,但组合E中有较多的厚垣孢子产生,木霉厚垣孢子在土壤中的存活能力要优于分生孢子[5],且有研究表明木霉的分生孢子接种到土壤浸出液中,厚垣孢子能很快形成[6].

木霉生防制剂施放田间后,受田间环境的影响,生防效力降低,原因之一就是发酵时条件优越而施放到田间后不适应环境所致.本试验表明在土壤中添加一定的营养物质可以显著提高木霉在土壤中的繁殖能力.添加葡萄糖以后,木霉在土壤浸渍液中的菌丝干质量和产孢量均有了显著提升,这与许传坤等[1]的研究结果一致.磷酸二氢钾对木霉菌丝生长和产孢量有促进作用,这与庄敬华等[7]的研究结果一致.尿素可以促进木霉分生孢子的产生,这与郎剑锋等[3]、Ashok等[8]研究结果是一致的,但陈小均等[9]和高增贵等[2]的研究发现尿素抑制木霉生长,这应与培养基和菌株不同有关.尤其是玉米秸秆煎汁与尿素的组合,大幅度提高了木霉的分生孢子产量,说明秸秆和肥料不但可以培肥地力[10],还可以促进木霉孢子的增殖.酵母浸膏和马铃薯煎汁对木霉菌丝生长和产孢有促进作用,这与高增贵[2]等的研究结果相同.匡崇婷等[11]研究发现在土壤中添加一定量的生物质炭显著提高了土壤微生物生物量,但在本试验中,生物质炭对木霉菌丝生长和产孢没有影响,这可能是由于匡崇婷等是在具黏性的红壤中添加的生物质炭,而本研究是在三角瓶中发酵培养,微生物量主要靠转速和培养基决定.枣果中含有丰富的营养物质,在基础培养基中加入枣果煎汁后,木霉菌丝干质量大幅增加,但产孢量很低,且枣果成本较高,不适于在田间使用.

[1]许传坤,莫明和,张克勤.土壤对木霉生防菌株的抑制作用及这种作用的解除[J].南京师大学报（自然科学版）,2004, 27（2）：77-80.

[2]高增贵,赵世波,庄敬华,等.常用土壤杀菌剂和肥料对绿色木霉菌T23的影响[J].植物保护学报,2008,35（1）：74-80.

[3]郎剑锋,孔凡彬,田雪亮,等.不同营养水平下化肥对哈茨木霉生长的影响[J].核农学报,2015,29（10）：2020-2025.

[4]孙晓棠,青姚,刘琼光,等.利用DGGE评价不同培养基回收番茄根际细菌类群的能力[J].微生物学报,2006,46（3）：482-486.

[5]CALDWELLR.Fate ofspores of Trichoderma viride Pers.ex Fr.introduced into soil[J].Nature,1958,181（4616）：1144-1145.

[6]PARKD.Chlamydospores and survivalin soilfungi.[J].Nature,1954,173（4401）：454-455.

[7]庄敬华,高增贵,刘限,等.营养元素对木霉菌防治甜瓜枯萎病效果的影响[J].植物保护学报,2004,31（4）：359-364.

[8]ASHOK M,SHARMA S D,PATEL S L.Influence of fertilizers on the growth and spore germination of Trichoderma harzianum Rifai[J].AgriculturalScience Digest,2003,23（4）：285-287.

[9]陈小均,燕嗣皇,吴石平.氮磷钾肥对木霉菌丝生长和产孢的影响[J].贵州农业科学,2005,33（2）：34-35.

[10]劳秀荣,孙伟红,王真,等.秸秆还田与化肥配合施用对土壤肥力的影响[J].土壤学报,2003,40（4）：618-623.

[11]匡崇婷,江春玉,李忠佩,等.添加生物质炭对红壤水稻土有机碳矿化和微生物生物量的影响[J].土壤,2012,44（4）：570-575.

（责任编辑：邓天福）

Effects of adding different additive on the growth of Trichoderma pseudokoningii strain St-zn-9 on soil-impregnantmedia

FENG Zhenyu,YANG Rui,HUO Yunfeng,LANG Jianfeng,SHI Mingwang
（SchoolofResource and Environment,Henan Institute ofScience and Technology,Xinxiang 453003, China）

To determine the ability ofadditive to break the soilfungistasisto Trichoderma pseudokoningii St-zn-9,using the soil-impregnantmedia as the basic culture medium,the effectof add differentadditive nutrients to the mycelium dry weight and spore production were studied.The results showed that different additives on the mycelium dry weight and spore production of T.pseudokoningii St-zn-9 were different,jujube infusion,glucose,urea,potassium dihydrogen phosphate,potato infusion and corn stalk infusionhave significant difference compared with control.Combination cultivation D（add corn stalk infusion and urea）was best,spore production mayachieved（14.17±0.38）×107/mL.

Trichoderma pseudokoningii；mycelium dry weight；spore production

S476.1

A

1008-7516（2017）02-0011-04

10.3969/j.issn.1008-7516.2017.02.003

2017-03-14

“十二五”国家科技支撑计划项目（2015BAD26B01）；河南省教育厅高等学校重点科研项目（17A210006）；国家级大学生创新训练项目（2015CX052）

冯振宇（1994—）,男,河南安阳人,本科生.

郎剑锋（1979—）,男,山西高平人,硕士,实验师.主要从事植物病害生物防治研究工作.