3种温阳健脾汤药对非酒精性脂肪肝细胞增殖与凋亡的影响

杨家耀+陶冬青+刘嵩+张书+马威+时昭红

[摘要] 通過油酸诱导正常肝细胞株LO2构建非酒精性脂肪肝细胞模型，探讨四君子汤、理中汤和附子理中汤对非酒精性脂肪肝细胞增殖与凋亡的影响。不同浓度的油酸诱导正常肝细胞株LO2构建非酒精性脂肪肝细胞模型，油红O染色观察非酒精性脂肪肝细胞的脂滴形成状况；全自动生化分析仪检测细胞上清液中天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平。分别设正常组、模型组、模型+四君子汤组、模型+理中汤组和模型+附子理中汤组，MTT检测各组细胞增殖情况；流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况；Western blot检测各组细胞中PCNA，cleaved caspase-3，cleaved caspase-8，cleaved caspase-9，Bax和Bcl-2蛋白的表达情况。油红O染色结果显示，与低浓度诱导相比，80 mg·L-1油酸诱导非酒精性脂肪肝细胞模型效果最佳，且诱导成功后细胞上清液中AST，ALT，TC和TG含量显著升高（P<0.01）。MTT和流式细胞仪检测结果显示，四君子汤、理中汤和附子理中汤均能有效促进非酒精性脂肪肝细胞的增殖并抑制其凋亡（P<0.01），且附子理中汤的作用效果最佳。Western blot检测结果显示，四君子汤、理中汤和附子理中汤能下调非酒精性脂肪肝细胞中cleaved caspase-3，cleaved caspase-8，cleaved caspase-9和Bax蛋白表达量，上调PCNA和Bcl-2蛋白的表达量，且附子理中汤的调节效果较其他2组药物处理更显著。该实验表明四君子汤、理中汤和附子理中汤均能有效促进非酒精性脂肪肝细胞的增殖并抑制其凋亡，且附子理中汤的作用效果最佳，其药效机制可能与3种汤药介导增殖与凋亡相关通路中关键因子的表达有关。

[关键词] 四君子汤；理中汤；附子理中汤；非酒精性脂肪肝；LO2细胞株

Effects of three Wenyang Jianpi Tang on cell proliferation and

apoptosis of nonalcoholic fatty liver cells

YANG Jia-yao1*， TAO Dong-qing2， LIU Song1， ZHANG Shu1， MA Wei1， SHI Zhao-hong1

（1. Wuhan Integrated Traditional Chinese Medicine & Western Medicine Hospital（Wuhan No.1 Hospital）， Wuhan 430022， China；

2. Zhongshan Hospital， Medical College of Wuhan University， Wuhan 430026， China）

[Abstract] To investigate the effects of Sijunzi Tang， Lizhong Tang and Fuzi Lizhong Tang on the cell proliferation and apoptosis of nonalcoholic fatty liver cells through the nonalcoholic fatty liver cell model established by inducing L02 cells with oleic acid. Different concentrations of oleic acid were added into L02 cells to induce the nonalcoholic fatty liver cell model. Oil red O staining was used to observe fatty droplets of fatty liver cells. Automatic biochemical analyzer was used to detect the levels of aspartic transaminase（AST）， alanine aminotransferase（ALT）， total cholesterol（TC）， and triglyceride（TG） in the cell supernatants. There were five groups， namely normal group， model group， model and Sijunzi Tang group， model and Lizhong Tang group， and model and Fuzi Lizhong Tang group. The cell proliferation and apoptosis of the five groups were detected by MTT colorimetry test and flow cytometer. The expressions of PCNA， cleaved caspase-3， cleaved caspase-8， cleaved caspase-9， Bax and Bcl-2 proteins of the five groups were detected by Western blot. The oil red O staining results showed that the optimum concentration of oleic acid that was used to induce nonalcoholic fatty liver cell models was 80 mg·L-1. The levels of AST， ALT， TC and TG in the nonalcoholic fatty liver cell supernatants were higher than that in normal liver cell supernatants（P<0.01）. MTT colorimetry test and flow cytometer results showed that all of Sijunzi Tang， Lizhong Tang and Fuzi Lizhong Tang could effectively promote the cell proliferation， and inhibit the cellular apoptosis of nonalcoholic fatty liver cells（P<0.01）. And Fuzi Lizhong Tang showed the best effect. Western blot results showed that Sijunzi Tang， Lizhong Tang and Fuzi Lizhong Tang could down-regulate the expressions of cleaved caspase-3， cleaved caspase-8， cleaved caspase-9 and Bax proteins， and up-regulate the expressions of PCNA and Bcl-2 proteins of nonalcoholic fatty liver cells. And Fuzi Lizhong Tang showed the best effect. In conclusion， all of Sijunzi Tang， Lizhong Tang and Fuzi Lizhong Tang could effectively promote the cell proliferation， and inhibit the cellular apoptosis of nonalcoholic fatty liver cells. And Fuzi Lizhong Tang showed the best effect. The pharmacodynamic mechanism may be related to the expressions of key factors in pathways related with proliferation and apoptosis mediated by the three decoctions.

[Key words] Sijunzi Tang； Lizhong Tang； Fuzi Lizhong Tang； nonalcoholic fatty liver disease； LO2 cell line

近年来，随着人们生活水平的提高，非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease， NAFLD）的发病率呈现逐年上升的趋势，已有的研究已证实NAFLD与2型糖尿病、代谢综合征以及相关的心脑血管病有一定的相关性[1-2]，且其后期发展可导致非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohetitis，NASH）、肝硬化以及肝癌等重症疾病，严重威胁着人类的健康[3]。关于NAFLD的动物模型研究较多，但由于动物模型会出现个体差异大、实验相关条件不易控制、周期较长以及稳定性差等缺陷，越来越多的研究者采用离体细胞模型进行脂肪肝相关研究，细胞模型能有效缩短研究周期；实验重复性较好；且有利于非酒精性脂肪肝发病机制的相关研究以及大规模的药物筛选[4-5]。中医药认为脾虚、湿热和痰瘀为脂肪肝病机的关键[6]，因此，本研究采用体外细胞模型进行相关研究，旨在探讨四君子汤、理中汤和附子理中汤3种具有温阳健脾功效的汤药对非酒精性脂肪肝细胞增殖与凋亡的影响，为临床上非酒精性脂肪肝的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株 本研究所用的人正常肝细胞株LO2（货号JL10103）由武汉华联科生物技术有限公司代购。

1.2 药物 四君子汤（益气健脾）、理中汤（温阳化气）和附子理中汤（温中健脾）的中药配方见表1，按照《方剂学》[7-8]确定各药物所用剂量（本实验用党参15 g替代人参9 g），所有药材均购自湖北天济中药饮片有限公司，党参（批号201602010）、茯苓（批号201602004）、白术（批号201602011）、炙甘草（批号201602011）、干姜（批号20160127）、炮附子（批号201601015），以上药材均由武汉中西医结合医院余南才主任鉴定合格。3种中药根据配方按常法煎煮2次，合并2次滤液，于水浴锅上将药液浓缩至每1 mL含4 g药材，将其溶于RPMI-1640培养基中，调整药物质量浓度为400 g·L-1，于4 ℃保存备用，临用前用RPMI-1640培养基稀释为40 g·L-1。由华中科技大学同济医学院附属武汉中西医结合医院中心实验室代加工。

1.3 试剂和设备 油酸（货号O1008）由武汉华联科生物技术有限公司代购；油红O（货号PAB10010018）和四甲基偶氮唑盐（MTT，货号PAB180013）均购自中国Bioswamp公司；胎牛血清（货号10270-106）购自美国Gibco公司；RPMI-1640培养液（货号SH30809.01B）和DMEM（货号SH30022.01B）购自美国Hyclone公司；丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒（货号20142400109）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒（货号20142400119）、总胆固醇（TC）试剂盒（货号20142400134）、甘油三酯（TG）试剂盒（货号20142400135）均购自宁波美康生物科技股份有限公司。显微镜来自美国Olympus公司；东芝TBA-40FR全自动生化分析仪来自东芝医疗系统（中国）有限公司；酶标仪来自美国Thermo公司。纯化兔抗人PCNA（货号ab18197），cleaved caspase-3（货号ab2302），cleaved caspase-8（货号ab25901），cleaved caspase-9（货号ab69514）和Bax（货号ab53154）多克隆抗体均购自美国Abcam公司；纯化兔抗人Bcl-2多克隆抗体购自美国CST公司（货号2872T）；山羊抗兔二抗购自中国Bioswamp公司（货号PAB160011）。

1.4 非酒精性脂肪肝细胞模型的构建 将人正常肝细胞株L02以1.5×105个/mL接种于6孔板中，在含5%CO2的孵箱中37 ℃孵育24 h，待细胞贴壁生长后，设对照组和模型组，每组设3个复孔。用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养液培养的细胞设为对照组；培养液中分别加入20，40，60，80 mg·L-1油酸设为模型组。对照组和实验组细胞分别进行油红O染色，400倍显微镜下观察并拍照。

1.5 生化检测 全自动生化分析仪检测对照组和模型组细胞上清液中AST，ALT，TC和TG水平。具体操作按照相应试剂盒说明书进行。

1.6 分组与给药 收集对数期细胞于96孔板中，5×104个/孔，每孔加入180 μL细胞悬液，模型组细胞中分别加入40 g·L-1的四君子汤、理中汤和附子理中汤20 μL，以200 μL培养液做空白对照，分别设正常组、模型组、模型+四君子汤组、模型+理中汤组和模型+附子理中汤组，每组设3个复孔，37 ℃培养过夜。

1.7 MTT和Annexin-V/PI双染分别检测细胞增殖和细胞凋亡 在以上药物处理24，48，72 h的细胞中加入90 μL新鲜培养液后再加入10 μL MTT溶液，继续培养4 h，然后吸去上清，每孔加入110 μL Formazan溶解液，将96孔板置于摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。按照Annexin-V/PI说明书对各组细胞进行染色，利用流式细胞仪檢测各组细胞凋亡情况。

1.8 Western blot检测各组细胞用药后的PCNA，cleaved caspase-3，cleaved caspase-8，cleaved caspase-9，Bax和Bcl-2蛋白表达情况 收集各组细胞，经PBS洗涤后裂解离心收集上清，BCA法测定蛋白浓度，将20 μL蛋白样品经12%的SDS-PAGE电泳分离后，转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉进行室温封闭1 h，TBST洗涤后加入一抗4 ℃孵育过夜，经TBST洗涤后，加入HRP标记的特异性二抗，室温孵育1 h，洗膜，ECL化学发光试剂对其曝光显影。

1.9 统计学分析 采用SPSS 19.0进行统计分析，实验数据以±s表示，组间差异采用方差分析和t检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 非酒精性脂肪肝细胞模型的建立 油红O染色结果见图1，对照组LO2细胞呈现多边形、细胞边缘清晰、胞质透明、细胞核呈现蓝色、极个别细胞胞质内可见极少量红色脂滴。20～60 mg·L-1油酸诱导的脂肪肝细胞中，部分细胞变圆、形状不规则、细胞胞质可见大小不一的红色脂滴。80 mg·L-1油酸诱导的脂肪肝细胞形状不规则、视野可见细胞的胞质中均有明显的红色脂滴环绕细胞核。因此，油酸诱导构建非酒精性脂肪肝细胞模型的最佳质量浓度为80 mg·L-1。

2.2 AST，ALT，TC和TG水平检测 模型组细胞上清液中AST，ALT，TC和TG水平均显著高于正常组细胞（P<0.01），进一步证实非酒精性脂肪肝细胞模型诱导成功，见表2。

2.3 对非酒精性脂肪肝细胞增殖的影响 与药物作用后48 h相比，各组细胞在药物作用后72 h的增殖能力有所下降，因此，判定药物作用的最适时间为48 h。与正常组相比，模型组细胞增殖能力明显下降（P<0.01），说明非酒精性脂肪肝细胞的增殖速度慢于正常细胞。药物作用48 h后，与模型组相比，模型+四君子汤组、模型+理中汤组和模型+附子理中汤组的细胞增殖能力明显上升（P<0.01），且模型+附子理中汤组的细胞增殖能力强于模型+四君子汤组和模型+理中汤组（P<0.05），但模型+四君子汤组和模型+理中汤组之间的差异无统计学意义，见表3。说明3种汤药都能促进非酒精性脂肪肝细胞的增殖，且附子理中汤的效果最佳。

2.4 对非酒精性脂肪肝细胞凋亡的影响 汤药处理48 h后，采用流式细胞仪进行细胞凋亡检测。与正常组相比，模型组、模型+四君子汤组、模型+理中汤组和模型+附子理中汤组的细胞凋亡率均显著升高（P<0.01）。与模型组相比，模型+四君子汤组、模型+理中汤组和模型+附子理中汤组的细胞凋亡率均显著降低（P<0.01）；3种汤药处理组组间进行比较，模型+附子理中汤组较其他2种汤药的细胞凋亡率有所下降（P<0.05），但模型+四君子汤组和模型+理中汤之间的差异无统计学意义，见图2。说明四君子汤、理中汤和附子理中汤均能有效抑制非酒精性脂肪肝细胞凋亡，且附子理中汤的抑制效果最佳。

2.5 对非酒精性脂肪肝细胞凋亡相关蛋白表达的影响 与正常组相比，模型组非酒精性脂肪肝细胞的促凋亡蛋白Bax和凋亡执行者cleaved caspase-3，cleaved caspase-8，cleaved caspase-9蛋白表达量上调，而抗凋亡蛋白Bcl-2和增殖相关蛋白PCNA的表达量下调，见图3。表明非酒精性脂肪肝细胞较正常细胞增殖能力下调，凋亡增加。与模型组相比，模型+四君子汤组、模型+理中汤组和模型+附子理中汤组细胞的cleaved caspase-3，cleaved caspase-8，cleaved caspase-9和Bax蛋白表达量出现下调，而PCNA和Bcl-2蛋白的表达量出现上调，且模型+附子理中汤组的调节效果最明显，见图4。表明3种汤药均能促进非酒精性脂肪肝细胞的增殖，抑制其凋亡的发生，其中附子理中汤效果最佳。

3 讨论

随着人们生活水平的提高，肥胖及代谢紊乱性疾病不断增加，NAFLD的发病率也逐年升高[9]。NAFLD是一种以肝脏内TG积聚为特征的肝脏性疾病，肝细胞出现脂肪变性进而引起肝细胞凋亡是其主要的细胞损伤机制[10]。关于NAFLD的动物模型研究较多，但由于动物模型会出现个体差异较大、实验相关条件不易控制、周期较长以及稳定性差等缺陷，越来越多的研究者采用离体细胞模型进行脂肪肝相关研究，细胞模型能有效缩短研究周期；其实验重复性较好；且有利于脂肪肝发病机制的相关研究以及大规模的药物筛选[4]。潘雪丰等[11]进行了油酸诱导的LO2与HepG2脂肪肝细胞模型的对比研究，结果表明LO2比HepG2更适合作为药物筛选的体外细胞模型。因此，本研究采用油酸诱导人正常肝细胞株LO2构建非酒精性脂肪肝细胞模型，并在此模型基础上进行药物作用研究，通过不同浓度的油酸诱导细胞并采用油红O染色观察细胞中脂滴形成情况，筛选出油酸的最适诱导质量浓度为80 mg·L-1。80 mg·L-1油酸诱导的非酒精性脂肪肝细胞上清液中AST，ALT，TC和TG水平均显著高于正常组细胞，说明离体非酒精性脂肪肝细胞模型造模成功。

NAFLD在古代医集中并无此病名，根据其临床表现可归于中医学的“肝痞”、“肝壅”、“胁痛”、“积聚”、“痰方”[12]。一般认为NAFLD的病因为饮食不節制、嗜甜油腻食物、肥胖等导致痰湿内盛、脾胃失调、肝失疏泄、脉络不和，有学者认为脂肪肝为“脾胃不足之源，乃阳气不足，阴气有余”，因而对于NAFLD的治疗应以温阳化气为主，恢复其脾胃功能[13]。目前，关于NAFLD的治疗主要以控制体重结合饮食治疗并辅以一定的药物治疗[9]，研究表明，随着NAFLD病情的发展，肝细胞凋亡逐渐增多，由于NAFLD的病因尚未完全阐明，且没有专用于治疗脂肪肝的药物，因此，研究中医药对肝细胞凋亡的影响进而了解中医药治疗脂肪肝的相关机制具有重要的意义。本研究中四君子汤、理中汤和附子理中汤三方共用党参、白术与炙甘草，这3味药均具有益气健脾的功效，四君子汤中的茯苓具有利水渗湿的功效，理中汤和附子理中汤中的干姜具有温运健脾的功效，附子理中汤多添加一味炮附子具有回阳救逆的功效[14-16]。此3种中药配方对于脂肪肝的治疗已有少许报道，柳涛等[14]分别采用四君子汤、理中汤、苓桂术甘汤和肾著汤喂食脂肪肝模型大鼠，观察4种中药对脂肪肝疗效的差异，结果表明苓桂术甘汤和肾著汤能有效促进大鼠脂肪代谢，四君子汤和理中汤对大鼠肝组织TG水平的影响无显著性差异。已有研究表明，四君子汤和理中汤能有效调节脾虚肠易激综合征大鼠血清及小肠组织中NO/NOS，MOT表达水平[15]，附子理中汤可有效降低临床脂肪肝患者的血脂和转氨酶[16]。目前还未有四君子汤、理中汤和附子理中汤作用于离体非酒精性脂肪肝细胞的相关报道，且其对于非酒精性脂肪肝的具体作用机制尚未阐明。因此，本研究采用四君子汤、理中汤和附子理中汤分别作用于离体非酒精性脂肪肝细胞模型，探讨其作用效果及相关机制，结果表明四君子汤、理中汤和附子理中汤均能有效促进非酒精性脂肪肝细胞的增殖并抑制其凋亡，且附子理中汤的作用效果最佳。

由于细胞凋亡与非酒精性脂肪肝的发生发展密切相关，而PCNA，caspase-3，caspase-8，caspase-9，Bax和Bcl-2基因是增殖与凋亡相关通路中的关键因子。正常细胞的caspase-3，caspase-8和caspase-9处于非活化的状态，当细胞应激凋亡刺激时，细胞通过一系列的应激反应，最终通过caspase级联反应诱导caspase切割并活化（如cleaved caspase-3，cleaved caspase-8和cleaved caspase-9），最终诱导凋亡发生，其中caspase-8和caspase-9分别参与细胞凋亡的死亡受体凋亡途径和线粒体凋亡途径。Bax与Bcl-2分别具有促凋亡和抗凋亡作用，PCNA与细胞增殖密切相关[17]。因此，本研究采用Western blot检测各组细胞在四君子汤、理中汤和附子理中汤作用48 h时细胞中PCNA，cleaved caspase-3，cleaved caspase-8，cleaved caspase-9，Bax和Bcl-2蛋白的表达，以探讨药物作用效果及其相关机制。结果表明药物作用于非酒精性脂肪肝细胞后，cleaved caspase-3，cleaved caspase-8，cleaved caspase-9和Bax蛋白的表达量降低，PCNA和Bcl-2蛋白的表达量升高，且3种汤药组组间比较发现，附子理中汤的趋势较其他2种汤药更明显。表明，3种汤药均能够增加非酒精性脂肪肝细胞的增殖相关蛋白和抗凋亡蛋白的表达，同时能够降低促凋亡相关蛋白及凋亡执行者的蛋白表达。

综上所述，四君子汤、理中汤和附子理中汤3种汤药均能有效促进非酒精性脂肪肝细胞的增殖并抑制其凋亡，且附子理中汤的效果最佳，其作用机制可能是通过上调周期相关蛋白和抗凋亡蛋白并下调促凋亡蛋白及凋亡执行者的表达来实现的。由于本研究仅从细胞模型方面研究中药配方对非酒精性脂肪肝的作用效果，属于基础性研究，因此，后续将继续针对中药配方对非酒精性脂肪肝动物模型和临床患者的作用效果及其具体作用机制进一步深入研究。

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[责任编辑 张宁宁]