唐立红,柴 圆,王博华,孙宝莹,桂晓慧
(赤峰学院 生命科学学院,内蒙古 赤峰 024000)
植物叶制片技术的改进探讨
唐立红,柴 圆,王博华,孙宝莹,桂晓慧
(赤峰学院 生命科学学院,内蒙古 赤峰 024000)
本研究基于传统石蜡制片方法,以多种处于幼嫩、柔软生长状态的植物叶片为试材,针对固定、脱水与透明、浸蜡与包埋、展片及烤片等制片环节,从试剂的处理浓度、处理时间、处理温度等方面进行改良,探索出适合幼嫩、柔软植物叶的制片方法.
植物叶片;石蜡切片;改进;幼嫩;柔软
石蜡制片是观察植物组织结构常用的技术之一,在研究植物形态建成、植物杂交育种、特殊植物的培育和鉴别等方面有着重要的应用[1].该技术运用石蜡与植物组织能够很好地结合这一基本原理,经过标本采集、固定、脱水(Ⅰ)、透明(Ⅰ)、浸蜡、包埋、切片、展片、烤片、脱蜡、复水、染色、脱水(Ⅱ)、透明(Ⅱ)和封片等一系列特殊处理步骤制作而成[2].在植物显微观察过程中,优良切片应具备组织结构完整、薄厚适当、组织面平整、染色清晰和反差强度大等特点.由于试材组织学和发育特征不同,其制片效果差异较大.幼嫩、柔软的植物材料,运用传统石蜡切片技术流程进行制片,常出现组织面破坏、结构不完整、染色不良等问题.近年来有学者对其制作方法进行改进研究,但研究探索都只针对一种植物进行,实验结论具有局限性.本课题以多种处于幼嫩、柔软生长状态的植物叶片为试材,通过大量试验,对常规石蜡切片技术的一系列环节进行改良[3],旨在探索出适合幼嫩、柔软植物材料的石蜡切片方法,为植物形态解剖学研究提供一定的技术支持.
1.1 试验仪器
CS101-A型电热鼓风干燥箱(重庆试验设备厂)、YD-6D生物组织包埋机(金华市益迪医疗设备有限公司)、HM325石蜡切片机(德国MICROM)、YD-A生物组织摊片机(金华市益迪医疗设备有限公司)、YD-B生物组织烤片机(金华市益迪医疗设备有限公司)、CX41生物显微镜(日本OLYMPUS).
1.2 试验材料
试验材料均采自赤峰学院校园或实验室内.于2015年4月至2015年6月期间,分别选取暴马丁香(Syring reticulata)、山杏(Prunus armeniaca)、蒙古栎(Quercus mogolica)、文冠(Xanthoceras sorbifolium)、紫丁香(Syringa oblata)、花红(Malus asiatica)、五叶地锦 (Parthenocissus quinquefolia)、龙爪槐 (Sophora japonica)、烟草 (Nicotiana tabacum)、高粱(Sorghum bicolor)幼嫩、柔软且生长状态良好的叶,在叶片1/2处切取1.2cm×0.5cm带中脉的部分,放入FAA固定液中.
1.3 试验方法
在传统石蜡切片制作方法的基础上,对固定、脱水与透明、浸蜡与包埋、展片及烤片等制片环节[4],从试剂的处理浓度、处理时间、处理温度等方面进行改良试验,筛选出适合幼嫩、柔软植物叶片的石蜡制片方法.
1.3.1 固定 固定是取材后的第一个环节,主要目的是通过化学药品的作用保存试验材料组织、细胞的形态结构,防止其变形、自溶和腐败.植物制片常用的固定剂为FAA液,是用60%(或70%酒精)、冰醋酸、福尔马林按18:1:1比例混匀制成.本试验降低了酒精溶液浓度,将60%酒精溶液替换为50%酒精溶液.试验材料切取后立即将其投入配置好的FAA固定液中固定.
1.3.2 脱水与透明 常规石蜡制片采用乙醇梯度脱水、二甲苯透明[5],具体方式为50%乙醇(ALC)(1h)→70%ALC(1h)→85%ALC(1.5h)→95%ALC(2h)→100%ALC(2h);1/2无水乙醇1/2二甲苯(2h)→二甲苯(2h).本试验增加了脱水梯度并缩短了每级脱水、透明时间.具体操作为将试验材料从FAA固定液中取出分别装到包埋盒中,经各级乙醇、二甲苯溶液进行脱水、透明处理.乙醇浓度、脱水和透明时间依次为30% ALC(30min)→50%ALC(20min)→70%ALC(20min)→85%ALC (20min)→95%ALC(20min)→100%ALC(15min)→100%ALC(15min);1/2无水乙醇 1/2二甲苯(20min)→二甲苯(20min).
1.3.3 浸蜡与包埋 本试验将透明后的材料取出后直接放入1:1的无水乙醇:蜡屑的饱和溶液中,并置于38℃恒温箱中12h后移入62℃熔融的纯蜡(熔点为56℃~58℃)中,每隔4h更换一次纯蜡(共换两次).将渗透好石蜡的植物材料直接立于包埋盒内的熔蜡中进行石蜡包埋.包埋时蜡台、蜡嘴、蜡锅温度调整为60℃、68℃、62℃.改变了传统的材料与蜡屑同时放入的方式,纯蜡的透浸由3次改为2次,处理温度在原操作基础上也相应的做了下调.
1.3.4 展片及烤片 展片在44℃水浴锅中进行,将无破损的材料切片捞至载玻片中央,并置于37℃烤片机上进行干燥固定,24小时后进行染色处理.展片的温度由原来的45℃调整为44℃;烤片温度也由38℃改变为37℃.
明确各环节对不同试验材料最佳的处理方式,对各环节的处理方式进行优化组合试验.在传统石蜡制片方法基础上进行制片,观察切片效果,筛选最佳方案.
幼嫩、柔软的植物叶片,运用改良方法制得的永久切片,其形态结构完整、细胞界限清晰、染色反差大、切片整洁,具有较好地观察效果(图1).
柔软幼嫩的植物组织,其含水量相对较大、质地韧性低、结构抗性差.低浓度的酒精固定液可缓和材料制片时的破碎反应.30%的酒精梯度脱水及脱水透明时间的缩短,减缓了脱水剂、透明剂引起的组织收缩反应,处理后的材料其硬度下降,制片不易破碎.
浸蜡时材料直接放入融好的无水乙醇、蜡屑的饱和溶液中,可使材料与石蜡更好的有机融浸,切片时材料韧性增加,不易破碎.纯蜡透浸数减少及浸蜡、包埋时温度的下调,缓解了高温对幼嫩材料的破坏作用,从而降低了制片的破碎度.
本课题研究初步显示,幼嫩、柔软状态的植物叶片,可利用改良方法进行制片.具体实验流程为:(1)固定:用50%酒精溶液的FAA固定液固定24h以上.(2)脱水与透明:将固定液中的植物材料取出后依次放入30%ALC(30min)→50%ALC(20min)→70%ALC(20min)→85%ALC(20min)→95% ALC(20min)→100%ALC(15min)→100%ALC(15min);1/2无水乙醇1/2二甲苯混合液(20min)→二甲苯(20min).(3)浸蜡与包埋:1/2二甲苯1/2蜡屑饱和溶液(置38℃恒温箱中12小时),次日换纯蜡:每隔4h更换一次纯蜡(共换两次)[6].包埋温度设置为62℃.(4)切片与干燥:展片在44℃水浴锅中进行,在37℃烤片机上进行烤片(至少24h后可进行染色处理).(5)染色与封片:按常规步骤进行.
制片过程还要注意以下事项:
3.1 幼嫩、柔软状态的植物试材比重轻,包埋时不易立稳,故取材时可适当增加材料的切取宽度,以提高包埋环节的材料稳固性.
3.2 包埋应一次完成,防止中间出现温差,造成蜡块包埋不均匀[7].包埋时蜡台、蜡嘴温度设置为60℃、68℃效果较好.包埋过程中所使用的镊子在取材前应进行预热,防止镊子尖端使石蜡凝固,不利于操作.冷却蜡块时不要降温的太快,容易使蜡块变脆,不易进行切片.
3.3 切片成败不仅与切片前的系列处理有关,而且与切片的操作也密切相关.包埋好的蜡块要用刀片去掉周围多余的蜡,将其修整,放在切片机相应位置.切片前要调整好刀片的角度,蜡块切面要保持与刀片平行.在操作过程中,要不断清理刀片及蜡块周围的残蜡,避免蜡带断裂和弯曲.
3.4 展片时水浴锅中最好用蒸馏水,避免杂质浮于蜡带上.
3.5 封片时要根据盖玻片的大小来评估所需树胶的滴数,树胶过多,可在干燥后用刀刮去,并用纱布蘸二甲苯拭去其残余的树胶[8];若树胶过少,则用玻璃棒加滴树胶在盖玻片的边缘补足.封片时要避免口、鼻对切片呼吸,以免产生雾气,影响切片质量.如果封片时产生气泡,可快速扫过酒精灯火焰,能有效赶出气泡.
图1 十种幼嫩、柔软植物叶横切结构
3.6 制片过程由多个环节组成,需要连续的时间来操作.因此,事先要制定好工作日程计划,以保证制片工作的顺利完成.
〔1〕潘叶,冯永庆,马焕普.一种适用于植物组织的快速石蜡制片法[J].中国农学通报,2008,24(3):112-115.
〔2〕杨虎彪,李晓霞,罗丽娟.植物石蜡制片中透明和脱蜡技术的改良[J].植物学报,2009,44(2):230-235.
〔3〕李素坤,张秋芝,郝玉兰.玉米成熟期茎杆石蜡切片方法的研究[J].安徽农业科学,2010,38(8):3935-3937.
〔4〕田晨霞,张咏梅,马晖玲.草地早熟禾胚胎结构石蜡切片制作方法初探[J].草业科学,2013,30(12):1980-1986.
〔5〕田珑,张卫光.正丁醇脱水制作肝组织石蜡切片[J].解剖科学进展,2004,10(2):190.
〔6〕王静,左幸,黄正文.常规植物石蜡制片技术的改进及应用[J].安徽农学通报,2011,17(11):36-39.
〔7〕杨捷频.常规石蜡切片方法的改良[J].生物学杂志,2006,23 (1):45-46.
〔8〕王金平,张俊梅.白头翁花的石蜡切片制作[J].信阳师范学院学报,2008,21(4):573-576.
Q-34
A
1673-260X(2017)04-0006-02
2017-02-03