评价ITS、BenA和CaM序列分析在曲霉菌种鉴定方面的应用

李颖 徐英春

(中国医学科学院北京协和医院检验科 中国医学科学院北京协和医学院研究生院，北京 100730)

·论著·

评价ITS、BenA和CaM序列分析在曲霉菌种鉴定方面的应用

李颖 徐英春

(中国医学科学院北京协和医院检验科 中国医学科学院北京协和医学院研究生院，北京 100730)

目的 评价内转录间隔区 (ITS)、β-微管蛋白基因 (BenA)和钙调蛋白基因 (CaM)序列分析技术对曲霉的鉴定能力。方法 对169株曲霉临床分离株分别进行ITS、BenA和CaM序列测定，并在Genbank数据库中进行比对分析以获得其菌种鉴定信息。结果 169株曲霉经ITS、BenA和CaM序列分析分别有52.7%、66.3%、97.6%菌株鉴定至种水平，47.3%、33.7%、2.4%菌株鉴定至属水平，3个序列对曲霉均不存在无法鉴定情况。结论 ITS、BenA和CaM均可用于曲霉菌种鉴定，其中以CaM的鉴定能力最强。

内转录间隔区 (ITS)；β-微管蛋白基因 (BenA)；钙调蛋白基因 (CaM)；序列分析；曲霉；菌种鉴定

随着罹患自身免疫病、艾滋病、肿瘤等恶性疾病患者数量的不断增多，侵袭性曲霉病在临床的发病率也逐年升高[1-3]。曲霉种类繁多，分类复杂，不同菌种间耐药谱存在一定差别，如土曲霉对抗真菌药两性霉素B天然耐药，烟曲霉复合群中的缓慢曲霉种对大多数临床抗真菌药物敏感性低[4-5]。因此，准确鉴定曲霉菌种对于指导临床用药具有重要意义。目前临床上对曲霉的分类鉴定主要依靠传统的形态学方法，包括直接观察培养菌落形态、颜色、质地以及镜下查找特征性菌丝、孢子等结构。该方法鉴定能力不足，且对鉴定人员的经验及技术要求较高[6]。近些年来，基因序列分析技术在微生物鉴定领域应用越发广泛，通过该技术能够将受试菌株准确鉴定到种水平。本研究拟对目前使用较广泛的真菌鉴定通用DNA靶标内转录间隔区 (Internal Transcribed Spacer，ITS)以及曲霉β-微管蛋白 (β-tubulin)基因BenA和钙调蛋白 (calmodulin)基因CaM进行曲霉鉴定能力评估，为临床曲霉鉴定工作提供指导信息。

1 材料与方法

1.1 菌株

收集北京协和医院2015年9月～2016年3月分离自临床患者送检标本的曲霉 (剔除同一患者多次分离的菌株)，20%甘油低温保存菌种。

1.2 试剂材料

真菌用沙堡弱平皿培养基购自英国OXOID公司，基因组DNA提取采用德国QIAGEN DNA mini Kit试剂盒，2×Easy Taq PCR SuperMix购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3 方法

曲霉培养 取保存的曲霉菌种以3点式点种于沙堡弱平皿，封口膜密封平皿外围，倒置于28℃培养箱孵育。2～5 d后，平皿上长出丝状菌落 (直径2～3 cm)即可用于后续提取基因组DNA。

曲霉基因组DNA制备 生物安全柜内用无菌接种环刮取菌丝适量，置于装有300 μL灭菌水的微量离心管中。加入900 μL无水乙醇，混匀，静置5 min，起灭活菌体的作用。12 000 r/min离心3 min，弃上清。底部菌丝沉淀重悬于200 μL灭菌水中，余下步骤按照QIAGEN试剂盒说明进行。提取后的基因组DNA保存于-20℃备用。

基因扩增及测序 ITS扩增采用通用引物ITS1和ITS4，PCR反应条件参照文献[7]。BenA和CaM基因扩增参照文献[8]。PCR产物送生物技术公司进行核酸序列测定 (由北京睿博兴科生物技术有限公司完成)。

序列比对分析 将测序得到的ITS，BenA和CaM序列分别与Genbank数据库 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)进行BLAST同源序列比对，种属信息鉴定原则如下[9]：(1)鉴定至种水平：待分析菌株与数据库中最佳匹配种的序列相似度≥98%，且与其他种的序列相似度较最佳匹配种低≥0.8%。(2)鉴定至属水平：待分析菌株与数据库内最佳匹配种的序列相似度为95%～98%；或与数据库中同一属内、不同种间的序列相似度均≥98%，且彼此间相差<0.8%。(3)无法鉴定：待分析菌株与数据库内最佳匹配种的序列相似度<95%；或与不同属间的序列相似度均≥95%。

受试曲霉菌种判定 综合分析ITS，BenA和CaM序列分析结果，确定受试菌株的菌种信息。(1)明确至种水平：3个序列均鉴定至同一种水平；或1～2个序列鉴定至种水平，余下序列鉴定至属水平。(2)鉴定至属水平：3个序列鉴定结果指向同一属内不同种；或3个序列均鉴定至属水平；或1～2个序列鉴定至属水平，余下序列无法鉴定。(3)无法鉴定：3个序列鉴定结果指向不同属或均无法鉴定。

2 结 果

2.1 菌株信息

本研究共收集169株曲霉，分离自临床患者呼吸道、皮肤组织、胸腹水以及伤口分泌物等标本。全部菌株均经形态学初步鉴定，其中烟曲霉67株 (39.6%)，黄曲霉50株 (29.6%)，黑曲霉20株 (11.8%)，土曲霉10株 (5.9%)，构巢曲霉7株 (4.1%)，杂色曲霉2株 (1.2%)，仅鉴定到曲霉属13株 (7.8%)。

2.2 ITS、BenA和CaM对曲霉的鉴定能力

对169株曲霉分别进行ITS、BenA和CaM序列分析 (见表1)，3个序列对曲霉均不存在无法鉴定的情况。其中，ITS对曲霉的种水平鉴定率最低，仅为52.7% (89/169)，BenA对曲霉的种水平鉴定率为66.3% (112/169)，CaM对曲霉的种水平鉴定率最高，达97.6% (165/169)。导致3个序列对曲霉鉴定能力差异较大的原因主要表现在对黄曲霉、黑曲霉和构巢曲霉的鉴定上，其中CaM对3种曲霉鉴定能力高，全部菌株均被鉴定至种水平；ITS对3种曲霉鉴定能力差，绝大多数菌株仅能鉴定到属水平；BenA在黄曲霉鉴定方面表现较差，但在构巢曲霉和黑曲霉鉴定方面表现较佳。对于曲霉少见种，BenA和CaM的种水平鉴定率均高于ITS。

2.3 曲霉形态学鉴定与序列分析鉴定结果的比较

以3个序列分析鉴定结果为标准，对169株受试曲霉的形态学鉴定结果进行校正评估 (见表2)。其中，经形态学鉴定的烟曲霉、土曲霉和构巢曲霉均正确，但仍有5株烟曲霉和1株土曲霉经形态学仅鉴定至属水平而经序列分析鉴定至明确种水平。分别有1株黄曲霉和1株杂色曲霉经序列分析校正后为溜曲霉和聚多曲霉。4株塔宾曲霉和1株日本曲霉被形态学错误鉴定为黑曲霉。

3 讨 论

近年来，随着医学真菌学的不断发展，越来越多的病原性丝状真菌被发现，并且很多环境性丝状真菌也相继被报道可引起某些人群发病[10-12]。曲霉作为临床分离率最高的丝状真菌，其种类繁多，分类复杂，不同菌种间耐药谱多样；并且由于患者体内的免疫状态不同以及抗真菌药物的治疗作用，致使一些曲霉临床分离株形态不典型甚至发生变异。因此，单纯形态学鉴定往往不能解决曲霉菌种鉴定的难题。

表1 ITS、BenA和CaM对曲霉的鉴定能力 (%)

注：a.11株曲霉少见种包括4株塔宾曲霉，1株日本曲霉，1株溜曲霉，1株聚多曲霉，1株焦曲霉，1株泡盛曲霉以及2株经3个序列分析后仍仅能鉴定到曲霉属

表2 曲霉形态学鉴定与序列分析鉴定结果的比较

注：a.2株菌经形态学初步鉴定为曲霉，且经3个序列分析鉴定后仍仅能鉴定到曲霉属水平

ITS是位于真菌核糖体18S rDNA基因3’端与28S rDNA基因5’端之间的序列，具有“种间变异，种内保守”的特征，其通用引物ITS1和ITS4能够对绝大多数酵母菌和丝状真菌进行有效扩增及序列分析，已被广泛用作真菌分类鉴定的DNA靶标，但其鉴定能力略弱，多将待分析菌株鉴定至属水平或属内复合群水平，部分菌株经ITS可鉴定至种水平[13-14]。β-微管蛋白 (β-tubulin)和钙调蛋白 (calmodulin)均属于功能性蛋白质，参与细胞的多种生物代谢途径，其编码基因BenA和CaM的DNA序列在不同种属微生物间差异较大，导致其引物通用性受限，不同菌属间BenA和CaM引物序列多有不同[15-16]。

前期有研究表明，针对曲霉菌的分子鉴定，ITS仅能将大多数曲霉鉴定到属水平或进一步的复合群 (complex)水平，如黑曲霉复合群、黄曲霉复合群等。进一步地，则需BenA和 (或)CaM等蛋白编码基因对复合群内菌株进行准确种水平鉴定[17-18]。本研究中，通过ITS可将52.1%曲霉鉴定到种水平，余下菌株仅能鉴定至属水平或复合群水平，如绝大多数经形态学初步鉴定为黄曲霉的菌株经ITS鉴定，结果在黄曲霉、米曲霉、寄生曲霉等黄曲霉复合群内部菌种间无法区分。黑曲霉、塔宾曲霉、日本曲霉等黑曲霉复合群内菌种经ITS也不能完全鉴定到明确种水平。BenA对曲霉的鉴定能力尚可，但对黄曲霉鉴定能力较差。CaM对曲霉鉴定能力最佳，能将曲霉常见种进行准确鉴定，也能对部分曲霉罕见种进行种水平鉴定。

综上所述，本研究拟提出如下曲霉临床分离株鉴定策略：对于经形态学初步鉴定至曲霉属的丝状真菌，若需要进一步获得其种水平信息，可使用CaM序列分析鉴定。若经形态学鉴定在曲霉属和其他菌属间无法区分，则应优先考虑进行ITS序列分析，在明确属水平信息后进一步按需选择适合该属菌株的高分辨率基因或序列进行种水平鉴定。

[1] Taccone FS,Van den Abeele AM,Bulpa P,et al.Epidemiology of invasive aspergillosis in critically ill patients:clinical presentation,underlying conditions,and outcomes[J].Crit Care,2015,19:7.DOI 10.1186/s13054-014-0722-7.

[2] Liao Y,Chen M,Hartmann T,et al.Epidemiology of opportunistic invasive fungal infections in China:review of literature[J].Chin Med J (Engl),2013,126(2):361-368.

[3] Kosmidis C,Denning DW.The clinical spectrum of pulmonary aspergillosis[J].Thorax,2015,70(3):270-277.

[4] Krijgsheld P,Bleichrodt R,van Veluw GJ,et al.Development inAspergillus[J].Stud Mycol,2013,74(1):1-29.

[5] Samson RA,Visagie CM,Houbraken J,et al.Phylogeny,identification and nomenclature of the genusAspergillus[J].Stud Mycol,2014,78:141-173.

[6] Hettick JM,Green BJ,Buskirk AD,et al.Discrimination ofAspergillusisolates at the species and strain level by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry fingerprinting[J].Anal Biochem,2008,380(2):276-281.

[7] Ciardo DE,Lucke K,Imhof A,et al.Systematic internal transcribed spacer sequence analysis for identification of clinical mold isolates in diagnostic mycology:a 5-year study[J].J Clin Microbiol,2010,48(8):2809-2813.

[8] Emily WT Tam,Jonathan HK Chen,Eunice CL Lau,et al.Misidentification ofAspergillusnomiusandAspergillustamariiasAspergillusflavus:characterization by internal transcribed spacer,β-tubulin,and calmodulin gene sequencing,metabolic fingerprinting,and matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry[J].J Clin Microbiol,2014,52(4):1153-1160.

[9] Schulthess B,Ledermann R,Mouttet F,et al.Use of the Bruker MALDI Biotyper for identification of molds in the clinical mycology laboratory[J].J Clin Microbiol,2014,52(8):2797-2803.

[10] Lass-Flörl C.The changing face of epidemiology of invasive fungal disease in Europe[J].Mycoses,2009,52(3):197-205.

[11] Masih A,Singh PK,Kathuria S,et al.Identification by molecular methods and matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry and antifungal susceptibility profiles of clinically significant rareAspergillusspecies in a referral chest hospital in Delhi,India[J].J Clin Microbiol,2016,54(9):2354-2364.

[12] Kontoyiannis DP,Marr KA,Park BJ,et al.Prospective surveillance for invasive fungal infections in hematopoietic stem cell transplant recipients,2001-2006:overview of the Transplant-Associated Infection Surveillance Network (TRANSNET) database[J].Clin Infect Dis,2010,50(8):1091-1100.

[13] Rittenoura WR,Ciacciob CE,Barnesb CS,et al.Internal transcribed spacer rRNA gene sequencing analysis of fungal diversity in Kansas city indoor environments[J].Environ Sci Process Impacts,2014,16(1):33-43.

[14] Schoch CL,Seifert KA,Huhndorf S,et al.Nuclear ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region as a universal DNA barcode marker for fungi[J].Proc Natl Acad Sci USA,2012,109(16):6241-6246.

[15] Ahmadi B,Mirhendi H,Makimura K,et al.Phylogenetic analysis of dermatophyte species using DNA sequence polymorphism in calmodulin gene[J].Med Mycol,2016,54(5):500-514.

[16] Wang H,Xiao M,Kong F,et al.Accurate and practical identification of 20Fusariumspecies by seven-locus sequence analysis and reverse line blot hybridization,and aninvitroantifungal susceptibility study[J].J Clin Microbiol,2011,49(5):1890-1898.

[17] Balajee SA,Houbraken J,Verweij PE,et al.Aspergillusspecies identification in the clinical setting[J].Stud Mycol,2007,59:39-46.

[18] Frédéric Lamoth.Aspergillusfumigatus-related species in clinical practice[J].Front Microbiol,2016,7:683.DOI 10.3389/fmicb.2016.00683.

[本文编辑] 施 慧

Evaluation of ITS,BenAandCaMin identification of clinicalAspergillus

LI Ying，XU Ying-chun

(DepartmentofClinicalLaboratory,PekingUnionMedicalCollegeHospital,GraduateSchool,PekingUnionMedicalCollege,ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100730,China)

Objective To evaluate the internal transcribed spacer (ITS),β-tubulin gene (BenA) and calmodulin gene (CaM) sequence analysis in identification of clinicalAspergillus.Methods All 169 strains ofAspergilluscollected from clinical patients were analyzed by ITS,BenA,CaMsequencing to obtain the species information with reference to the Genbank database.Results The tested strains were identified to species level with identification rates of 52.7% (89/169),66.3% (112/169),97.6% (165/169) and to genus level of 47.3% (80/169),33.7% (57/169),2.4% (4/169) by ITS,BenAandCaM,respectively.None of the three sequence markers failed in identification ofAspergillus.Conclusion ITS,BenAandCaMcan be used to identify clinicalAspergillus.Among them,CaMis the most efficient molecular marker forAspergillusidentification.

ITS;BenA;CaM;sequence analysis;Aspergillus;identification

74-77]

李颖，女 (汉族)，博士研究生在读.E-mail:bravezane@163.com

徐英春,E-mail:xycpumch@139.com

R 379.6

A

1673-3827(2017)12-0074-04

2016-11-22