两株白色不产孢烟曲霉形态学及毒力研究

姜媛 张彩云 王逢源 孔庆涛 张征 曾秋琼 龙南彪 桑红

(1.南京军区南京总医院皮肤科,南京 210002；2.南京师范大学生命科学学院,南京 210046)

·论著·

两株白色不产孢烟曲霉形态学及毒力研究

姜媛1张彩云1王逢源1孔庆涛1张征1曾秋琼1龙南彪2桑红1

(1.南京军区南京总医院皮肤科,南京 210002；2.南京师范大学生命科学学院,南京 210046)

目的 将先后发现的两株白色不产孢的烟曲霉A1j与A2j进行对比，观察其在形态学和毒力方面是否有差异。方法 通过真菌基因组DNA的保守序列ITS和β-tub的测序对A2j进行菌种鉴定；采用小培养方法在显微镜下比较A1j、A2j及标准株Af293的菌丝形态；观察A1j和A2j在不同培养时间和不同培养基上生长的菌落形态；在小鼠模型上测试其毒力变化。结果 通过ITS和β-tub的测序A2j被鉴定为烟曲霉；小培养发现A1j和A2j与标准菌株Af293不同，两者均为不产孢的烟曲霉，且两者生长速度明显不同；培养不同的时间和不同的培养基均不能诱导A1j和A2j产色和产孢，但是50℃下，A1j被限制生长，而A2j却能生长；在免疫抑制的小鼠模型中，与标准菌株Af293相比，A1j的毒力下降，但A2j小鼠的死亡数量、死亡速度与Af293相当，表明A2j的毒力并没有降低。结论 新发现的白色不产孢烟曲霉A2j与A1j在生长速度、耐热性和毒力方面均不同。

烟曲霉；鉴定；孢子形成；侵袭性曲霉病模型

烟曲霉是一种广泛存在于大自然的机会性致病菌，通常能够产生通过空气传播的孢子，孢子很容易沉积在肺部达到肺泡水平[1]。烟曲霉能够产生大量孢子，该孢子具有黏附性、耐氧化应激性以及耐热性，所以烟曲霉有较高的致病潜能。同时，它也能产生影响循环系统中性粒细胞的胶酶霉素[2-3]和具有一定毒力的黑色素。免疫抑制的患者为易感人群。一旦感染，其病死率极高[4]。健康人群可以通过完善的免疫系统及时清除孢子与菌丝，从而能够有效防止烟曲霉对人体重要器官和组织的损害[3]。

烟曲霉的鉴定传统的方法是依靠真菌培养阳性菌株的表型和温度试验等，容易判断不准确[5-6]。为了准确鉴定曲霉，使用核糖体内部转录间隔区 (ITS)序列扩增的分子生物学方法已经成为鉴定不同致病真菌的金标准[7]，然而，ITS序列扩增不能将A2j鉴定到种的水平，只能鉴定到组 (Section)的水平。因此，完善的菌种鉴定还需要进行分子生物学鉴定，如β-tubulin测序[8]。

我们实验组首次报道了第1株非典型的烟曲霉 (不产生黑色素和孢子)命名为A1j，且已对其形态学、毒力以及形态学差异相关的分子机制做了相关的研究[9]。本文将分离和鉴定到的另外一株罕见的不产孢烟曲霉临床株 (命名为A2j)，将其与A1j及标准株Af293在形态学、毒力进行比较后发现：尽管这两株菌都不产生孢子，但是它们在生长速度、耐热性及毒力都存在明显差异。我们第2次报道了这种特殊烟曲霉。这些方面的差异将有助于提高我们对这种白色不产孢烟曲霉的认识，也同时为我们接下来研究它们形态学相关分子机制方面奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌株和培养基

烟曲霉野生型293 (购于FGSC，真菌基因储存中心，生命科学院，美国密苏里大学，堪萨斯市，密苏里，美国)，A1j[9](从肺曲霉病患者组织标本中分离纯化的临床分离株，现保存于中国科学院皮肤病研究所)，A2j(从肺曲霉病患者组织标本分离纯化的临床分离株，现保存于中国科学院皮肤病研究所)。菌株主要采用YAG培养基[10]，其他培养基主要包括PDA、CDA、YPD、CA、MEA、CAY[6]。

1.2 光学显微镜观察

采用改进后的小培养法[9]：首先准备好足够的YAG培养基，用无菌手术刀将培养基切成7～10 mm的小培养基，然后在新的YAG培养基上放上5～6个小培养基，相互之间留有一定空间。用棉签在各个小培养基中央接种上菌，每个平板只接种1种菌，避免相互污染。各个菌在YAG小培养基上37℃培养18 h或者更长时间后用光学显微镜下进行观察。

1.3 毒力测试

接种菌悬液的准备 ①Af293菌悬液的配制：将Af293接种于YAG平板37℃培养2 d，用0.01% Tween 80收集孢子，经8层纱布过滤后用血细胞计数板计数，并稀释成108/mL的孢子悬液。②A1j和A2j菌悬液的配制：用接种针挑取A1j和A2j菌落于铺好玻璃滤纸的YAG固体培养基中同样在37℃培养2 d，然后从菌落边缘挑取菌丝传代到另一个铺好无菌玻璃纸的YAG固体平板，同样37℃恒温培养2 d，以获得不带培养基的A1j、A2j纯菌丝。然后用移液管吸取100 μL Af293的菌丝液以及刮取大约3 cm2A1j和A2j的菌丝片分别放入100 mL的YAG液体培养基中，接着将三者同时置于37℃的温控摇床中以220 r/min的速度培养18 h。然后用无菌纱布收集菌丝，并用滤纸吸干后以1 g菌丝∶10 mL生理盐水的比例放入匀浆器中研磨。然后转到玻璃管中备用。稀释10倍研磨液，使用分光光度计测定其在600 nm时的光密度值 (OD600)，将其调整到OD600=0.6，并用麦氏标准比浊管验证调整好的匀浆浓度 (10倍稀释液约为麦氏1号管浓度的4倍，即4个麦氏单位[11])。

小鼠感染模型的建立 ①实验动物及分组：6～8周龄清洁级ICR雄性小鼠52只 (购于南京师范大学实验动物中心)，体重30～35 g，随机分为Af293、A1j、A2j和生理盐水 (NS)四组，每组13只；10只用于观察存活率，绘制生存-时间曲线。②免疫抑制方法：环磷酰胺150 mg/kg体重，接种前3 d (-d3)、前1 d (-d1)腹腔注射1次/d，氢化可的松40 mg/kg体重-d1皮下注射1次/d (以感染当天为第0天)。感染后d3环磷酰胺75 mg/kg体重腹腔注射进行免疫抑制维持，为了避免细菌污染小鼠，在小鼠的饮用水中加入四环素 (1 mg/mL)[12]。③菌丝匀浆气管插管接种方法：在感染当天根据LI等[13]的方法先用1%戊巴比妥钠10 mL/kg进行麻醉，然后对各组小鼠分别采用气管插管接种方法接种50 μL的菌丝匀浆或者生理盐水。④绘制小鼠生存-时间曲线：每隔6 h观察小鼠的死亡只数，直到观察到感染的第16 d。用SPSS 13.0软件、描绘小鼠生存-时间曲线图，以log-rank检验P<0.05为差异有显著统计学意义。⑤小鼠肺组织病理检查：观察发现小鼠死亡后，立即取出解剖，右肺浸泡在10%甲醛溶液中留作PAS染色，左肺剪成碎块放置在有氯霉素的YAG培养基的平板上，37℃恒温培养2 d观察是否有菌落生长。

1.4 DNA提取和分析

使用真菌基因组提取试剂盒 (来自中国博日科技有限公司)基因组DNA。通用真菌引物对即：ITS1 (5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)用于扩增ITS基因[14]，benA-F (5’-AATTGGTGCCGCTTTCTGG-3’)和benA-R (5’-AGTTGTCGGGACGGAATAG-3’)扩增β-tub部分基因序列[15]。

2 结 果

2.1A2j的鉴定

我们对A2j的ITS区域和β-tubulin基因进行了测序。ITS序列的同源性：在NCBI中，A2j为99%，在AspGD中，A2j为99.5%。β-tub序列的同源性：在NCBI中，A2j为100%，在AspGD中，A2j为99.8%。因此A2j被准确鉴定为A.fumigatus。

2.2A2j的形态学特征

将两株菌都放在YAG培养基上37℃下培养1 d、3 d、4 d和6 d，并同时放在光学显微镜下观察，我们观察到两株菌表现为毛茸茸的白色菌落，但是A2j生长速度比A1j快，生长速度与Af293相当 (见图1a)。光学显微镜下发现A1j和A2j均表现为分支分隔的菌丝但是没有孢子的产生，但是Af293可见典型的产孢结构 (见图1b)。

为研究不同的培养基或者不同的温度能否使不产孢烟曲霉A1j和A2j恢复孢子的形成以及比较两者形态学方面的差异，我们将A1j和A2j分别接种于YAG、PDA、CDA、SDA、YPD、CA、CAY和MEA培养基上在37℃或者50℃的恒温培养箱中培养3 d或者5 d，我们发现尽管两株菌在不同的培养基上的生长速率不同，但是仍然是不产孢的。在37℃温度下，无论是培养3 d还是5 d，A2j的生长速率总是比A1j快。培养5 d后A2j平板几乎被菌落全部铺满。其中A1j在YAG和YPD培养基上生长速度最快而在CDA培养基上生长最慢。无论在哪种培养基上，A1j在50℃的温度条件下3 d和5 d均不能生长。但是A2j在PDA、CAY和YAG培养基上生长速度最快，A2j在CA培养基上生长最慢 (见图1c)。在50℃的温度条件下，A2j却能生长，且把其培养时间延长至14 d，仍然能生长。不仅如此，A2j在50℃的温度条件下培养5 d，PDA和YAG培养基上的小培养光学显微镜下观察均可见串珠状的异常形态菌丝 (见图1d)。

2.3 动物实验结果

A1j和A2j均可以导致免疫抑制的小鼠体内形成肺曲霉病，前者毒力降低，但是后者毒力并未降低。

为验证A2j与标准株Af293相比的毒力是否是下降的以及比较A1j和A2j毒力的差异，我们建立了免疫抑制的肺曲霉病的动物模型，发现生理盐水组所有的小鼠均存活到观察的终点。但Af293在观察的第14天全部死亡，A1j只在观察的前2 d死亡2只后一直保持不变，A1j和Af293的生存率分别是80%和0%，两者之间差异有统计学意义 (P<0.05)。A2j在前6 d死亡的较快 (40%)，到观察终点共死亡8只，其生存率为20%，与Af293相比，两者之间差异没有统计学意义 (P>0.05)(见图2)。

如图3所示在死亡于肺曲霉病的小鼠的病理切片 (PAS染色)中，可见3株烟曲霉均生长于气管腔内或者外壁的周围，且有大量炎症细胞浸润，并呈多灶性分布。从病理图片上可见A2j和Af293的病灶比A1j多，而A2j的病灶比Af293少。A1j的病灶在感染后3 d已经消失，但A2j的病灶仍然存在。这些结果表明A1j和A2j均可以在免疫抑制的小鼠身上诱导出曲霉病，不仅如此，与标准株Af293相比，A1j的毒力降低，而A2j的毒力并未下降。

3 讨 论

烟曲霉的鉴定传统方法不准确率往往很高。采用核糖体内部转录间隔区 (ITS)序列扩增的分子生物学方法已经成为鉴定不同致病真菌的金标准[7]，但是ITS测序只能鉴定到组的水平，β-tubulin测序可正确的鉴定到菌种水平。另之前报道的不产孢白色烟曲霉A1j已经通过采用ITS和β-tubulin测序的方法得以鉴定[9]。本文采用ITS和β-tubulin基因测序方法，且将得到的序列分别在NCBI和AspGD两个数据库中进行比对，与烟曲霉相似度均达到99%，因此A2j被准确鉴定为烟曲霉。

图1 a.不同培养时间A1j和A2j的菌落形态 (以Af293为对照)；b.A1j、A2j和Af293的光学显微镜下形态；c.不同培养基上及不同温度条件下培养的A1j和A2j菌落形态；d.50℃的温度条件下培养5 d,光学显微镜下观察均可见串珠状的异常形态菌丝 图2A1j,A2j和Af293小鼠感染实验生存-时间曲线 图3 感染2.5 d后各组小鼠的肺组织PAS染色图 (黑色箭头指示菌丝；上图放大倍数为10×，下图为40×)

Fig.1 a.Colony morphogenesis of different incubation periods ofA1jandA2jcompared to reference Af293;b.Morphogenesis ofA1j,A2jand Af293 under light microscope;c.Colony morphogenesis ofA1jandA2jinoculated on various medium types or at different temperatures;d.Abnormal germination and morphogenesis ofA2jinoculated on PDA and YAG medium for 5 days at 50℃ temperature under the microscope Fig.2 Survival curves of NS,A1j,A2jor Af293 infected mice Fig.3 Photographs of PAS stained lung sections of mice died in 2.5 days post-infection of indicated strains (Black arrows indicate hyphae.Photomicrographs of the upper line were 10×magnified,and below ones were 40×magnified)

Balajee等[6]研究发现延长生长时间或者用不同的培养基可能刺激不产孢或者产孢减弱的A.fumigatus缺陷株或变种产孢和产黑色素,又有研究报道烟曲霉很高的耐热性，甚至能够在70 ℃的高温条件下生长[16]。A1j和A2j同时进行此项研究却发现在相同的培养基上培养相同时间A1j比A2j生长慢，不同的培养基和延长时间均不能刺激两者产孢和产黑色素，在50℃的高温调节下A1j不能生长，A2j能够生长。据此我们推测A1j的耐热性没有A2j高，可能与两者耐热相关基因存在差异有关。

烟曲霉是一种机会性致病菌，胶酶霉素和黑色素是其非常重要的两种毒力因素[3-4]，新发现的两株烟曲霉A1j和A2j均不能产生黑色素和孢子。第1株非典型烟曲霉A1j已通过体内外研究发现其毒力与标准株Af293相比是下降的[9]。而与烟曲霉A1j不同的是：同样不产黑色素和孢子的烟曲霉A2j，在小鼠感染模型试验中，虽可导致免疫抑制的小鼠体内形成肺曲霉病，但是毒力并未降低，这与A1j结果相反，说明同样白色不产孢的两株烟曲霉其毒力是不同的。

感染小鼠模型中，A2j与Af293相比，两者的生存率并没有显著的差异，而A1j却增加了生存率。我们也观察到感染的小鼠中，A2j能生存足够长的时间 (>4 d)，且在4 d后死亡的A2j小鼠肺进行培养且做病理仍能培养出菌落及观察到A2j菌丝，A1j与其结果恰恰相反。Mellado等[17]研究得出chsC和chsG几丁质合成酶基因突变株不仅会使侵入性肺曲霉病的小鼠毒力下降，且生长速率也会降低。Paisley等[18]研究发现烟曲霉的毒力下降与生长速率成正相关。由此推测白色不产孢的烟曲霉毒力有所不同，可能与A2j生长速率比较快有关。A1j和A2j毒力方面差异还有待进一步研究。

既往研究表明侵袭性肺曲霉病组织病理学特征性的表现为在坏死肺组织区域菌丝呈45°角向肺实质延伸[19]。本研究发现，A1j和A2j组小鼠与模式菌株的Af293组小鼠肺组织病理学表现很相似：灶状分布的聚集菌丝团块，伴炎细胞浸润。

虽然A2j与已被发现的A1j形态学表现相似，但这种白色不产孢烟曲霉是否广泛存在依旧未知。两株不产孢的白色烟曲霉，毒力不同初步推测与其生长速度有关，耐热性不同与其耐热相关基因有关，但都有待进一步证实。因此，孢子抑制剂或者生长速度抑制剂能否成为下一代曲霉病治疗新方法有待研究。

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[本文编辑] 王 飞

Phenotypic characterization and virulence of two white nonsporulatingAspergillusfumigatusisolates

JIANG Yuan1,ZHANG Cai-yun1,WANG Feng-yuan1,KONG Qing-tao1,ZHANG Zheng1,ZENG Qiu-qiong1,LONG Nan-biao2,SANG Hong1

(1.DepartmentofDermatology，JinlingHospital,MedicalSchoolofNanjingUniversity,NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryRegion，PLA，Nanjing210002，China;2.JiangsuKeyLaboratoryforMicrobesandFunctionalGenomics,JiangsuEngineeringandTechnologyResearchCenterforMicrobiology,CollegeofLifeSciences,NanjingNormalUniversity,Nanjing210046,China)

Objective In this study,another white nonsporulatingA.fumigatusstrain (named asA2j) was compared with reported nonsporulating strainA1jin terms of morphology and virulence.MethodsA2jwas confirmed by DNA sequencing of internal transcribed spacer (ITS) regions and partialb-tubulin genes.We incubatedA1jandA2jthrough the slide culture method to compare them under a microscope.We observe the morphology ofA1jandA2jat different times or on various medium types.An immunosuppressed mice model was created to compare the virulence ofA1j,A2jand Af293.ResultsA2jwas accurately identified asA.fumigatusby ITS and β-tubulin sequencing.BothA1jandA2jshowed abnormal germination under the microscope compared to those of the reference strain Af293 by the slide culture method.Neither increased time nor different medium types could stimulate the formation of spores and pigment.A1jcannot grow andA2jcan grow at 50℃.A1jis hypovirulentin immunosuppressed mice model;however,A2jis virulent compared to the standard strain Af293.Conclusion The newlyA.fumigatusA2jandA1jhave significant differences in growth rate,thermotolerance and virulence.

Aspergillusfumigatus;Identification;Sporulation;Invasive aspergillosis model

69-73]

国家自然科学基金 (81330035,81371782)

姜媛，女 (汉族)，硕士研究生在读.E-mail:njujyuan@126.com

桑红,E-mail:sanghong@nju.edu.cn

R 379.6

A

1673-3827(2017)12-0069-05

2017-02-06