转化生长因子对巨噬细胞抗新生隐球菌功能的影响

李颖芳 桑军军 李娟 姜伟伟 廖万清 潘炜华

(上海长征医院皮肤病与真菌病研究所 全军真菌病重点实验室 第二军医大学附属长征医院皮肤科，上海 200003)

·论著·

转化生长因子对巨噬细胞抗新生隐球菌功能的影响

李颖芳 桑军军 李娟 姜伟伟 廖万清 潘炜华

(上海长征医院皮肤病与真菌病研究所 全军真菌病重点实验室 第二军医大学附属长征医院皮肤科，上海 200003)

目的 研究转化生长因子对巨噬细胞吞噬和杀伤新生隐球菌 (Cryptococcusneoformans)功能的影响。方法 采用TGF-β干预体外活化巨噬细胞吞噬和杀伤实验，分别观察巨噬细胞吞噬率和巨噬细胞内隐球菌生长情况，采用Griess regent试剂盒检测巨噬细胞NO (Nitric oxide)生成量,并比较TGF-β干预下巨噬细胞NO生成量变化。结果 TGF-β干预后巨噬细胞吞噬率下降了43.9%，差异有统计学意义 (P<0.05)。巨噬细胞在转化生长因子干预下NO生成量增加，胞内隐球菌负荷降低，差异有统计学意义 (P<0.05)。结论 体外细胞实验中，在TGF-β干预下活化巨噬细胞的趋化作用和吞噬能力受抑制，但巨噬细胞合成NO量增加，杀伤隐球菌能力增强。

新生隐球菌；转化生长因子；巨噬细胞

隐球菌是临床上最重要的深部真菌病感染源之一，其中新生隐球菌 (Cryptococcusneoformans)主要感染免疫功能抑制的患者，可引发具有致命性的隐球菌性脑膜炎[1]。

吞噬细胞是新生隐球菌侵入宿主体内所遭遇的第一类免疫细胞，人体的吞噬细胞主要有巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞和中性粒细胞等，其中单核/巨噬细胞是宿主抗隐球菌感染最主要的效应细胞之一[2-3]。巨噬细胞一方面通过内吞与氧化杀伤的方式在第一时间非特异性地抵抗入侵的隐球菌，另一方面以释放趋化因子的方式募集T细胞至感染部位，形成局部细胞因子微环境，并通过抗原递呈调控后续获得性免疫[4]。

转化生长因子 (TGF-β)主要由淋巴细胞或巨噬细胞产生，在调节细胞免疫过程中起重要作用，它被认为是免疫抑制的一个重要因素[5-6]。TGF-β可抑制巨噬细胞吞噬反应，减少趋化因子的产生，减轻炎症反应[7]。本研究旨在探索TGF-β对巨噬细胞在吞噬、杀伤隐球菌方面的影响，从而深入了解TGF-β在机体抗隐球菌感染方面的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株 选用新生隐球菌标准株H99 (第二军医大学长征医院皮肤病与真菌病研究所真菌库)。

细胞 小鼠单核巨噬细胞J774A.1 (上海生科院巴斯德研究所孟广勋研究员惠赠)。

培养基 YPD固体培养基：10% Yeast Extract (酵母膏)+20% Peptone (蛋白胨)+20% Glucose (葡萄糖)+20% Agar (琼脂粉)，YPD液体培养基不加琼脂粉，均购自国药集团化学试剂有限公司；DMEM细胞培养基：DMEM+10% FBS (胎牛血清)+1%双抗 (Penicillin-Streptomycin)购自美国Gibco公司。

主要试剂 重组小鼠转化生长因子TGF-β1 (美国R&D公司)，小鼠TGF-β1单克隆抗体 (美国R&D公司)，氨基胍盐酸盐 (德国Sigma-Aldrich公司)，瑞氏-吉姆萨复合染液 (北京Leagene生物技术有限公司)，一氧化氮检测试剂盒Griess regent (碧云天生物技术公司)。

主要仪器和耗材 CO2恒温培养箱 (德国Hetaeus公司)，普通光学显微镜 (德国Zeiss蔡司)，倒置显微镜 (德国Zeiss蔡司)，分光光度计 (美国BIO-RAD公司)，Spectrostar nano高通量紫外分光光度计 (德国BMG LABTECH公司)，6孔细胞培养板和96孔细胞培养板 (美国Corning公司)。

1.2 实验方法

菌株的复苏和菌悬液的配置 从-80℃冰箱取出新生隐球菌标准株H99，用接种环挑取菌液，接种于YPD固体培养基上，置于30℃恒温培养箱培养3 d。从平板上挑取单克隆菌落接种至YPD液体培养基，30℃，220 r/min过夜。

巨噬细胞的复苏及培养 巨噬细胞从液氮罐中取出，迅速于37℃恒温水浴箱中溶化，取解冻的细胞悬浮液置于DMEM培养基，放入二氧化碳培养箱 (5% CO2)，37℃环境培养。

巨噬细胞吞噬实验 将J774A.1巨噬细胞浓度调至2×106/mL，接种至6孔板中细胞爬片上，并加入IFN-γ和LPS激活巨噬细胞。分三组干预，A组为阴性对照，B组按100 ng/mL加入TGF-β干预，C组加入TGF-β单克隆抗体和TGF-β干预，孵育2 h。将H99菌悬液浓度调整至2×106cells/mL并加入隐球菌荚膜抗体mAb 18b7共孵育后感染巨噬细胞，孵育2 h。取出细胞爬片缓缓冲洗，用无水甲醇固定10 min，弃去甲醇，加入1∶10稀释 (PBS)的Giemsa染液于4℃染色2 h，冲洗烘干后置于显微镜下观察，每块细胞爬片取4个视野观察，取平均值。吞噬指数=视野中所有被吞噬的隐球菌数目/视野中所有巨噬细胞数目。

巨噬细胞杀伤实验 将2×106/mL巨噬细胞接种于96孔板内，加入激活培养基，将浓度为2×106cells/mL的隐球菌感染巨噬细胞，孵育2 h后PBS洗涤3遍。之后分3组干预，A组加入DMEM培养基，B组TGF-β 100 ng/mL+DMEM培养基，C组加入含抗TGF-β 100 ng/mL+DMEM培养基150 μL (提前已加入TGF-β单克隆抗体)，孵育24 h。加入0.5% SDS,室温下孵育5 min，吸打若干次使巨噬细胞充分裂解，将裂解产物稀释后涂板计数。

一氧化氮检测 于96孔内接种2×106/mL巨噬细胞，加入IFN-γ和LPS，分4组干预，A组不加TGF-β干预，B组按加入TGF-β，C组加入1 mmol/L iNOS抑制剂氨基胍+TGF-β，孵育1 h。将H99隐球菌悬液加入A、B、C组中，继续孵育20 h，D组为对照组，不予隐球菌感染巨噬细胞。使用Griess regent检测NO含量，反应结束后在540 nm处测定样品吸光度，收集数据。

1.3 数据处理及统计学分析

所有实验均独立重复3次，数据应用SPSS 23.0软件进行处理，巨噬细胞吞噬率、巨噬细胞内隐球菌负荷和NO含量比较均采用t检验进行统计学分析，以P<0.05视为有统计学意义的标准。

2 结 果

2.1 TGF-β对巨噬细胞吞噬功能的影响

吉姆萨染色后高倍镜下观察，J774A.1巨噬细胞胞浆呈淡染，巨噬细胞细胞核及隐球菌菌体呈深染，隐球菌荚膜不被染色，表现为菌体周围的白色光晕 (见图1)，观察巨噬细胞趋化和吞噬情况，计算每组巨噬细胞吞噬率。

统计各组巨噬细胞吞噬率，结果显示TGF-β干预时，巨噬细胞趋化作用减弱，吞噬指数较对照组下降了43.9%，差异有统计学意义 (P<0.05)。而加入TGF-β单克隆抗体可阻断TGF-β对巨噬细胞吞噬功能的影响，巨噬细胞趋化作用恢复，巨噬细胞吞噬率与阴性对照组接近 (见图2)。

2.2 TGF-β对J774.1巨噬细胞杀伤隐球菌能力的影响

将巨噬细胞裂解产物涂板培养，统计后发现，TGF-β干预巨噬细胞后，被巨噬细胞吞入胞内的隐球菌存活率下降明显，菌落负荷下降，表明巨噬细胞在TGF-β干预后胞内杀伤能力升高 (P<0.05)。为进一步证明TGF-β在对巨噬细胞杀伤能力方面的影响，提前加入TGF-β单克隆抗体干预，可见TGF-β活性被单克隆抗体阻断，巨噬细胞杀伤胞内隐球菌的功能未增强 (见图3)。

2.3 TGF-β对J774.1巨噬细胞NO合成量的影响

本实验中未予隐球菌感染的对照组，巨噬细胞NO合成量极低，在予以新生隐球菌感染后，NO含量上升，其中TGF-β干预组NO含量升高较未加TGF-β组升高显著，差异有统计学意义 (P<0.05)，但在加入一氧化氮合酶抑制剂氨基胍后，NO合成显著受抑制 (见图4)。

图1 左图黑色箭头所指为巨噬细胞趋化聚集，巨噬细胞黏附及吞噬新生隐球菌，右图红色箭头所指J774A.1巨噬细胞，绿色箭头指为被黏附及吞噬的新生隐球菌 (放大倍数400×) 图2 TGF-β对J774A.1巨噬细胞吞噬指数影响 图3 TGF-β干预下对巨噬细胞内隐球菌负荷的影响 图4 TGF-β对J774.1巨噬细胞NO合成量的影响

Fig.1 The black arrow indicates macrophage chemotaxis,adhesion and phagocytosis ofC.neoformans(Left).The red arrow indicates J774A.1 macrophages and the green arrow points the adhered and swallowedC.neoformans(Right) (400×magnification) Fig.2 Effects of TGF-β treatment on J774A.1 macrophages phagocytic index Fig.3 Effects of TGF-β intervention on the intracellular CFU ofC.neoformansFig.4 Effects of TGF-β intervention on nitric oxide synthesis in J774A.1 macrophages

3 讨 论

肺巨噬细胞是隐球菌进入机体内接触的第一类免疫细胞，其在宿主抗隐球菌免疫反应中扮演双重角色[8]。巨噬细胞接触隐球菌后，一方面可吞噬杀伤隐球菌并可将抗原提呈给T淋巴细胞触发特异性免疫，使感染局限化进而清除隐球菌，而另一方面隐球菌可在巨噬细胞内生长增殖进而发展为肺隐球菌病，甚至可将巨噬细胞作为载体，通过“特洛伊木马”模型通过血脑屏障，进入中枢神经系统造成脑部感染。活化的巨噬细胞功能取决于细胞因子微环境，吞噬入巨噬细胞胞内隐球菌的命运与局部细胞因子微环境相关[9]。

转化生长因子TGF-β在调节炎症反应方面有重要作用[10]，而TGF-β在新生隐球菌感染宿主免疫方面的作用仍不明确。本研究从TGF-β对巨噬细胞功能的影响着手，体外细胞实验发现，加入TGF-β干预活化巨噬细胞时其趋化作用减弱，吞噬新生隐球菌能力呈现下降趋势，而在加入TGF-β单克隆抗体抑制其生物学功能后，巨噬细胞吞噬能力恢复，吞噬率与阴性对照组相近，说明TGF-β可抑制体外巨噬细胞吞噬功能，减少对新生隐球菌的吞噬。

巨噬细胞可通过氧化损伤方式杀伤隐球菌，隐球菌被吞入巨噬细胞后的结局取决于巨噬细胞的杀伤能力，进一步研究TGF-β对巨噬细胞杀伤功能的影响，我们发现，经TGF-β干预后，巨噬细胞胞内隐球菌生长受抑制，将巨噬细胞裂解后细胞液涂板计数，菌落负荷明显下降，且该效应可经TGF-β单克隆抗体阻断，表明TGF-β在增强巨噬细胞杀伤能力方面起一定作用。巨噬细胞可生成iNOS从而合成活性氮自由基NO而发挥抗菌作用，主要杀伤被吞噬的隐球菌[11]，本研究发现，在TGF-β干预下巨噬细胞NO生成量增加，加入iNOS抑制剂氨基胍后NO含量极低，说明TGF-β可通过增强iNOS活性从而促进NO的产生，进而增强巨噬细胞对隐球菌的杀伤能力。

综上，TGF-β可抑制巨噬细胞的趋化和吞噬作用，但可通过增强iNOS活性而提高巨噬细胞的杀伤能力，TGF-β干预下巨噬细胞胞内隐球菌生长受限。本实验仅在体外细胞实验层面研究TGF-β在巨噬细胞抗隐球菌当中的作用，转化生长因子在机体抗隐球菌方面的整体作用有待今后进一步研究，以寻找对隐球菌病干预治疗的新靶点。

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[本文编辑] 卫凤莲

Effects of transforming growth factor on the function of macrophage againstCryptococcusneoformans

LI Ying-Fang,SANG Jun-Jun,LI Juan,JIANG Wei-Wei,LIAO Wan-Qing,PAN Wei-Hua

(Departmentofdermatology，ChangzhengHospital，Instituteofdermatologyandmedicalmycology，ChangzhengHospital，Keylaboratoryofmolecularmedicalmycology，PLAkeylaboratoryofmedicalmycology，Shanghai200003)

Objective To investigate the phagocytosis and killing ability of macrophage under TGF-β intervention.Methods Using TGF-β intervene phagocytosis and killing assay of activated macrophagesinvitro.Phagocytic index of macrophage and the intracellular growth ofCryptococcusneoformanswas observed respectively.Nitric oxide (NO) production was detected using the Griess regent kit，and then comparing the changes of NO production in macrophages under the TGF-β intervention.Results The phagocytic index with the treatment of TGF-β decreased by 43.9%,significantly lower than control group (P<0.05).While the production of NO increased and the intracellular fungal burden significantly declined under the intervention of TGF-β (P<0.05).Conclusion Chemotaxis and phagocytosis of activated macrophage were inhibited under the intervention of TGF-βinvitro,but the NO production increased and killing ability enhanced.

Cryptococcusneoformans；transforming growth factor；macrophage

65-68]

973项目 (2013CB531606),国家自然基金 (31270180)

李颖芳，女 (汉族)，硕士研究生在读.E-mail:liyingfang99@163.com

潘炜华,E-mail:panweihua@medmail.com.cn

R 379.5

A

1673-3827(2017)12-0065-04

2017-03-03