全切片扫描在肾组织轻链型淀粉样物质沉积患者研究中的应用

芮昊辰 吕亚男 杨 帆 范 芸 李晓梅 徐 峰 成水芹 梁少姗 黄湘华 刘志红 曾彩虹

全切片扫描在肾组织轻链型淀粉样物质沉积患者研究中的应用

芮昊辰1吕亚男1杨 帆1范 芸2李晓梅1徐 峰1成水芹1梁少姗1黄湘华1刘志红1曾彩虹1

目的：探讨轻链型淀粉样变性(AL型)淀粉样物质在肾组织沉积部位及程度与临床表现及预后的关系。 方法：回顾分析经肾活检确诊的AL型淀粉样变性患者的临床病理资料，利用全切片扫描技术计算淀粉样物质占组织的百分比，分析其与临床及预后的关系。 结果：AL型淀粉样变性患者259例，男性147例，中位年龄57岁，肾脏均受累，肠道受累71.06%，心脏受累43.22%。中位病程7月，蛋白尿4.80±3.15 g/24h，19.31%的患者肾功能不全。中位随访时间22.3月，患者平均生存时间24.24月，1、2、3和5年人生存率分别为81.8%、64.1%、52.4%和29.6%；肾脏生存率分别为90.8%、82.3%、76.8%和47.8%。淀粉样物质累及肾小球(99.61%)，肾血管(92.66%)和肾间质(50.19%)。淀粉样物质占肾小球、肾血管、肾间质及整个肾组织的百分比分别为11.81%±11.38%、14.14%±14.05%、3.34%±5.36%和4.25%±5.77%，且与多项临床指标具有相关性。淀粉样物质占肾小球百分比、年龄、尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)及尿视黄醇结合蛋白(RBP)为患者预后的独立危险因素。淀粉样物质占肾血管、肾间质及整个肾组织百分比，血清肌酐，尿RBP为肾脏预后的独立危险因素。 结论：全切片扫描定量分析是观察淀粉样物质在肾脏不同部位沉积及其程度的有效方法，并证实蛋白尿、血清肌酐等与淀粉样物质肾脏不同部位沉积有一定相关性。肾脏不同部位淀粉样物质沉积与患者预后和肾脏预后相关。

轻链型淀粉样变性 全切片扫描分析 临床特点 预后

轻链型系统性淀粉样变性(AL型)是免疫球蛋白轻链或轻链片段异常折叠后沉积于组织和器官形成淀粉丝，致其功能障碍甚至衰竭的一种慢性疾病[1-3]。淀粉样物质可沉积于多个器官，肾脏是常见受累器官之一[4-5]。淀粉样物质在肾小球、肾血管和肾间质沉积也有差别。AL型淀粉样变性主要依靠组织病理诊断，已有较多关于临床指标对淀粉样变性患者预后影响的研究[6-9]。少数研究通过半定量分析AL型淀粉样变性，提出肾脏病理分型，认为不同分级与治疗及预后具有相关性[7,10]。但半定量分析影响因素多，随着全切片扫描技术(whole slide imaging,WSI)及数字病理的应用，可减少上述影响因素。本研究通过WSI定量分析AL型淀粉样物质在肾脏的沉积，探讨其沉积部位及程度与患者的临床指标及预后的关系。

对象和方法

研究对象 2003年3月至2015年10月在南京军区南京总医院肾脏科住院经肾活检确诊的AL型淀粉样变性患者。入选标准：(1)刚果红染色阳性，偏振光下呈苹果绿双折光，免疫荧光见单克隆κ或λ轻链沉积；(2)刚果红染色切片完整；(3)随访时间≥3个月或在3个月内已达随访终点。

临床资料 收集患者的一般资料和临床病理资料。临床指标定义：肾功能不全定义为：血清肌酐>109.6 μmol/L。随访主要终点为患者死亡，次要终点为进入终末期肾病(ESRD)或开始透析。淀粉样变性器官受累参考国际标准[11]。

肾脏病理 入组患者均行肾活检术，并按常规行光镜、免疫荧光及电镜检查。刚果红染色切片5 μm；冰冻切片间接法观察κ、λ轻链的沉积情况。

全切片扫描定量分析 基于肾活检石蜡刚果红染色切片，利用Aperio数字病理系统(ScanScope AT Turbo)进行全切片扫描，通过相关配套软件计算出刚果红染色阳性区域面积，整个肾组织、肾小球及肾血管的面积，肾间质面积定义为整个肾组织减去肾小球、肾血管的面积。分别计算肾小球、肾血管、肾间质及整个肾组织的刚果红染色阳性面积占其相应部位面积的百分比，定义为淀粉样物质占肾小球、肾血管、肾间质和整个肾组织的百分比。

统计学方法 采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差或中位数(四分位间距)描述，分类变量用率表示。相关性分析采用Pearson及Spearman相关分析。生存分析应用Kaplan-Meier法，生存相关危险因素分析采用COX回归模型。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一般资料、临床表现和实验室检查 259例AL型淀粉样变性患者肾活检时的一般资料、临床表现及实验室检查见表1。男性147例，女性112例，中位年龄57岁，λ轻链型233例，κ轻链型26例。78.39%患者为多器官受累，单纯肾脏受累者仅21.61%。151例患者接受直肠黏膜活检，124例(82.12%)患者刚果红染色阳性，82例接受皮肤脂肪活检的患者刚果红染色阳性者63例(76.83%)。

肾组织病理及淀粉样物质沉积部位和程度 AL型淀粉样变性患者肾活检组织学特点见表2。62.55%的患者伴球性硬化(球性硬化比例9.58%±12.61%)，1.54%的患者伴节段硬化(节段硬化比例9.96%±10.44%)。刚果红染色肾小球、肾血管及肾间质同时阳性者88例(33.98%)，仅小球与血管同时阳性者116例(44.77%)，仅血管与间质同时阳性者124例(47.88%)，仅小球与间质同时阳性者6例(2.32%)。

全切片扫描刚果红染色切片后定量分析结果见表2。不同轻链类型之间结果无差异，肾小球、肾血管淀粉样物质比例明显高于肾间质。

表1 AL型淀粉样变性患者临床及实验室特点

eGFR：估算的肾小球滤过率；RBP：视黄醇结合蛋白；NAG：N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶

表2 AL型淀粉样变性患者病理特点

*：与肾间质沉积百分比比较，P<0.05

肾组织淀粉样物质沉积部位和程度与临床指标的相关性 因κ轻链型患者例数少，对λ轻链型和整个AL型淀粉样变性患者各项指标进行相关性分析。发现淀粉样物质占各项百分比与多个指标之间存在明显相关性(表3)。

肾组织淀粉样物质沉积部位和程度与预后的关系 患者的平均随访时间27.22±22.54个月，中位生存时间18.6个月(0.8～91.4个月)，1年、2年、3年和5年的患者生存率分别为81.8%、64.1%、52.4%和29.6%(图1A)；肾脏生存率分别为90.8%、82.3%、76.8%和47.8%。采用ROC曲线评价各部位淀粉样物质沉积百分比对患者生存的预测价值，获得淀粉样物质占肾小球、肾血管、肾间质和整个肾组织百分比对人生存率的最佳截断值，并以最佳截断值为分界，将患者分为两组，发现淀粉样物质占肾小球、肾血管及整个肾组织的百分比高于最佳截断值的患者人生存率差(图1B～D)；淀粉样物质占肾小球、肾血管、肾间质及整个肾组织百分比最佳截断值以上者肾脏生存率差(图1E～H)。

表3 AL型淀粉样变性患者淀粉样物质在部位沉积程度与临床、实验室指标相关性

eGFR：估算的肾小球滤过率；RBP：视黄醇结合蛋白；NAG：N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶；#：P<0.05；*：P<0.01

图1 AL型淀粉样变性患者最佳截断值分组生存曲线及肾脏生存曲线A：患者总体生存曲线；B：肾小球分组生存曲线；C：肾血管分组生存曲线；D：整个肾组织分组生存曲线；E：肾小球分组肾脏生存曲线；F：肾血管分组肾脏生存曲线；G：肾间质分组肾脏生存曲线；H：整个肾组织分组肾脏生存曲线

单因素回归分析表明淀粉样物质占肾小球、肾血管、肾间质及整个肾组织百分比、年龄、心脏受累、肝脏受累、尿NAG酶、RBP、血清肌酐、eGFR、低血压和尿素氮都与患者生存预后密切相关，但多因素回归分析仅淀粉样物质占肾小球百分比、年龄、尿NAG酶、RBP是患者生存预后的独立危险因素。对肾脏预后进行单因素回归分析，淀粉样物质占肾小球、肾血管、肾间质及整个肾组织百分比，血清肌酐，eGFR，蛋白尿，尿NAG酶，RBP和尿素氮均为肾脏进展为ESRD的危险因素，多因素回归表明淀粉样物质占肾血管、肾间质及整个肾组织百分比、血清肌及RBP为进展至ESRD的独立危险因素。

讨 论

关于系统性淀粉样变性的流行病学调查较少，Kyle等[12]报道系统性淀粉样变性每百万人每年发病率为8.9人，英国的Pinney等[13]报道AL型淀粉样变性每十万人的发病率为0.3人。Said等[5]发现淀粉样变性占肾活检比率为2.12%，其中AL型占淀粉样变性的比率为81.01%，AL型占肾活检比率1.72%。Panizo等[14]发现淀粉样变性占肾活检比率为3.70%。南京军区南京总医院报道肾淀粉样变性占肾活检比率为0.56%[15]。北京协和医学院报道AL型淀粉样变性占肾活检比率0.79%[7]。AL型淀粉样变性患者以λ轻链型明显多于κ型。Huang等[6]报道λ型占85.71%，Yao等[7]报道占86.02%。本组患者λ型占89.96%。

AL型淀粉样变性临床表现缺乏特异性，早期易误诊或漏诊。临床以累及肾脏就诊较为多见。国内研究发现63.5%～76.7%的AL型淀粉样变性患者表现为肾病综合征，肾功能不全发生率为18.6%～25%[7-8]。Gertz等[16]发现85.71%伴肾病综合征。Said等[5]发现轻链和轻重链淀粉样变性肾病综合征发生率68%，肾功能不全发生率高达47%。本组患者肾病综合征的发生率59.85%，肾功能不全的发生率为19.31%。黄湘华等[8]研究证实κ型较λ型患者肾功能不全发生率高，本研究也发现κ型患者肾功能不全的发生率及血清肌酐水平均明显高于λ患者。

关于淀粉样变性临床及实验室指标或治疗对患者预后的影响研究较多[8-9,16]，而病理指标对预后影响的报道十分有限。2010年,Sait等[17]系统回顾了肾脏淀粉样变性组织学分型，并提出了积分及分级方法。这一方法较复杂，且主观因素影响较多。Yao等[7]利用该方法证实肾脏淀粉样物质沉积的程度和部位与蛋白尿和肾功能相关，且沉积程度是人总体死亡率的独立预测因子。Oguchi等[18]利用数字照像及计算机定量分析家族性淀粉样变性得出肾小球淀粉样物质沉积百分比与尿蛋白相关，而与肾功能不相关，未区分肾血管和间质。

本研究首次对AL型淀粉样变性患者的刚果红染色进行全切片扫描，不仅减少主观影响，且区分肾小球，肾血管和肾间质，在方法学上具有一定优势。研究发现肾小球为最常沉积的部位，几乎同时沉积于肾血管，只有半数患者沉积于间质。与Yao等[7]报道的发生率相近，后者发现沉积以血管最多，小球次之，且均明显高于间质。

本研究发现患者蛋白尿与淀粉样物质占肾小球沉积百分比呈正相关，血清肌酐则与淀粉样物质占肾小球、血管、间质和整个肾组织沉积百分比均呈正相关。进一步观察了λ型患者，发现与整体患者相比有不同，蛋白尿与肾小球、间质和整个肾组织沉积百分比均呈正相关。Yao等[7]的研究也证实蛋白尿和肾功能与肾小球淀粉样物质沉积相关，血管沉积积分高者，蛋白尿少，没有发现其与肾功能有明显相关。 Eirin等[19]发现局限于血管沉积的患者肾功能损害重，但蛋白尿程度轻。但本研究中，肾小球和肾血管几乎同时沉积。Osawa等[20]的研究发现肾间质淀粉样物质沉积与肾功能相关。

AL淀粉样变性患者的预后差异较大，未治疗者中位生存时间仅为6～15个月[13]。死亡原因多为器官功能不全的并发症[21]。黄湘华等[8]报道诊断时血清肌酐和低血压是肾脏预后的独立危险因素。本研究通过对淀粉样物质在肾脏不同部位沉积百分比对人生存率及肾脏生存率最佳截断值的确定，发现最佳截断值以下组的患者，生存情况及肾脏生存情况均优于最佳截断值以上组的患者。这说明淀粉样物质在肾脏及不同部位沉积程度与患者的人和肾生存率相关，与后者相关性更明显。

有文献报道AL淀粉样变性的预后相关危险因素，包括器官受累、年龄、血清肌酐等[21]。单器官受累预后明显好于多器官受累，心脏和肝脏受累是患者预后影响的独立危险因素。肾脏受累对人预后影响并不明显，这可能与透析等治疗手段可替代肾脏功能有关。本研究重点对淀粉样物质在肾脏及不同部位沉积百分比与预后相关因素进行分析。多因素分析仅肾小球淀粉样物质沉积百分比是患者生存预后的独立危险因素。肾脏作为AL淀粉样变性最常见的受累器官，多因淀粉样物质的沉积而导致ESRD。有报道42%累及肾脏的AL淀粉样变性患者需要透析治疗，且开始透析后1年内的死亡率达45%，但最常见的死亡原因仍是心脏疾病[16]。本研究中，血清肌酐为患者肾脏进展为ESRD的独立危险因素，与意大利报道的结果类似[22]。同时，在本组患者中，淀粉样物质在肾血管、肾间质及整个肾组织沉积百分比是进展至ESRD的独立危险因素。由此可见，淀粉样物质在肾脏的沉积程度，与肾功能是否进展至ESRD有密切的联系，可在一定程度上反映肾脏预后的程度。

本研究为回顾性研究，由于时间跨度较大，资料存在部分缺失，对结果存在影响，且未考虑患者的治疗方案差异，对预后判断有一定的局限性。

小结：全切片扫描定量分析是观察淀粉样物质在肾脏不同部位沉积程度的有效方法，并发现肾血管和肾小球沉积明显高于肾间质。蛋白尿、血清肌酐与淀粉样物质肾脏不同部位沉积有一定相关性。肾脏不同部位淀粉样物质沉积与患者预后和肾脏预后相关。

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(本文编辑 凡 心)

Clinicopathologic features and outcomes of light-chain amyloidosis (AL) patients based on digital whole slide imaging

RUIHaochen1,LVYanan1,YANGFan1,FANYun2,LIXiaomei1,XUFeng1,CHENGShuiqing1,LIANGShaoshan1,HUANGXianghua1,LIUZhihong1,ZENGCaihong1

1NationalClinicalResearchCenterofKidneyDisease,JinlingHospital,NanjingUniversitySchoolofMedicine,Nanjing210016,China2WuxiPeople’sHospital,Wuxi214023,China

ZENGCaihong(E-mail：zengch_nj@hotmail.com)

Objective：To explore the location and severity of amyloid deposition on kidney and compare them with clinical features in patients with light-chain amyloidosis (AL). Methodology：The clinicopathological data of 259 patients with kidney biopsy-proven AL amyloidsis were retrospectively analyzed. The presence of amyloid was identified by positive congo red staining from digital whole slide imaging. Areas with amyloid deposition and glomerular, vascular and total tissue area were measured by digital WSI. Areas of amyloid deposition per total glomerular, vascular, interstitial and total tissue were calculated respectively using Aperio software. Results：They were 147 males and 102 females, with a median age of 57 years old. The patients frequently presented with edema and fatigue. The most common involved organ was kidney (100%), followed by gastrointestinal tract (71.1%) and heart (43.2%). The median disease duration was 7 months. The mean level of proteinuria was 4.80±3.15 g/24h. 50 patients had renal insufficiency. The median time of follow-up was 22.3 months, and the mean patient survival time was 24.2 months. The 1, 2, 3 and 5-year cumulative patient survival rates were 81.8%,64.1%,52.4% and 29.6%, and cumulative renal survival rates were 90.8%,82.3%,76.8% and 47.8%. The numbers of patients who had amyloid deposition in glomerular, vascular and interstitial areas were 258 (99.6%), 239 (92.7%) and 165 (50.2%) respectively. The rates of glomerular, vascular, interstitial and total tissue areas amyloid deposits were 11.8±11.4%, 14.1±14.1%, 3.34±5.36% and 4.25±5.77% respectively, which were associated with several clinical parameters. The rate of glomerular amyloid deposits, age, urinary N-acetyl-B-D-glucosaminidase to creatinine ratios (NAG) and retinol-binding protein (RBP) were important risk factors of patient survival. The rates of vascular, interstitial, total tissue areas amyloid deposits, serum creatinine (SCr) and RBP were important risk factors of renal survival. Conclusion：The digital whole slide imaging is convenient, practical and feasible in evaluation of amyloid deposits. The rates of glomerular and vascular amyloid deposit were same and higher than that in interstitial areas. Proteinuria and SCr were associated with amyloid deposition. The amyloid deposition was related with patient survival and renal survival.

light-chain amyloidosis whole scanning image clinical manifestation prognosis

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2017.02.003

国家重点研发计划课题(2016YFC0904103，2016YFC0901202)；国家科技支撑计划课题(2015BAI12B02，2015BAI12B05)

1南京大学医学院附属金陵医院(南京军区南京总医院)肾脏科 硕士研究生(芮昊辰) 国家肾脏疾病临床医学研究中心全军肾脏病研究所(南京，210016)；2无锡市人民医院

曾彩虹(E-mail:zengch_nj@hotmail.com)

2017-02-07

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