蝴蝶兰小麻雀的组培快繁技术

漆子钰+陈俊晖++林志刚 许丽秋 杨毅燕++吴沙沙+翟俊文+彭东辉

摘要：以蝴蝶兰小麻雀花梗为外植体培养成的原球茎为材料，研究不同培养基、生长调节剂和外源添加物对其增殖、分化和壮苗生根的影响。结果表明，原球茎增殖的最佳配方为1/2 MS+8.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L蛋白胨+25 g/L 蔗糖+5.2 g/L瓊脂，增殖系数最高（2.62）；原球茎分化的最佳配方为2.0 g/L花宝1号+0.2 mg/L 6-BA+01 mg/LNAA+100 mL/L椰汁+25 g/L蔗糖+5.2 g/L琼脂，分化率100%，平均叶片数为3.54张/株，平均株高 4.04 cm；最适合蝴蝶兰根诱导的培养基配方为2.0 g/L花宝1号+1.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+100 mg/L香蕉+25 g/L蔗糖+5.2 g/L琼脂，在该培养基上生根率100%，生根数最多（3.52条），平均根长最长（35.37 mm）。

关键词：蝴蝶兰；原球茎；组织培养；培养基；正交设计

中图分类号： S682.2+90.4+3文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）04-0035-04

蝴蝶兰属兰科（Orchidaceae）蝴蝶兰属（Phalaenopsis）的附生兰，于1750年被发现，原产于热带和亚热带[1]，因花朵的形状酷似蝴蝶而得其名，别称蝶兰[2]。蝴蝶兰花大色艳，可连续观赏2～3个月，因此很容易吸引大众的眼球。它与卡特兰、万代兰、石斛兰并称为四大观赏兰，素有“兰花皇后”之美称[3]，具有极高的观赏价值和经济价值。

小麻雀是福建漳州钜宝生物科技有限公司培育的蝴蝶兰新品种，花径5.5 cm，花葶高35 cm，花朵数在12朵/枝以上，属黄色系品种。其唇瓣为胭脂红，分枝多，与传统蝴蝶兰品种相比，花期长，达3～5个月，更加娇小，并且具香味，观赏性强，非常适合办公桌摆放。本试验以蝴蝶兰小麻雀的原球茎为试验材料，选用MS或花宝1号基本培养基，加入少量激素和外源添加物，对其增殖、分化、生根培养等方面进行研究，探索出蝴蝶兰小麻雀组培苗繁殖的最佳生长条件，以期提高生产效率，降低培养成本，提高蝴蝶兰小麻雀的市场竞争力。

1材料与方法

1.1试验材料

试验所用蝴蝶兰小麻雀无菌原球茎由漳州钜宝生物科技有限公司提供。

1.2试验方法

1.2.1增殖培养

以增殖4次、[JP2]不带叶的蝴蝶兰原球茎为材料，采用L9（34）正交试验设计[3]研究不同浓度MS基本培养基、6-BA、NAA、蛋白胨对蝴蝶兰原球茎增殖培养的影响。添加25 g/L蔗糖和5.2 g/L琼脂，每瓶接种3个原球茎，每个处理接种10瓶，3次重复。在光照时间12 h/d、光照度 1 000～1 500 lx、温度（25±2） ℃下。培养45 d，统计增殖系数。[JP]

1.2.2分化培养

以原球茎为材料，诱导蝴蝶兰小麻雀植株的分化。采用L9（34）正交试验研究不同浓度基本培养基、6-BA、NAA和椰汁对蝴蝶兰种苗分化培养的影响（表1）。每瓶接种3个原球茎，每个处理接种10瓶，3次重复，培养条件同“1.2.1”节，培养 45 d后统计叶片数、生根数，测量株高、叶长、叶宽。

1.2.3生根培养

取长势整齐、健壮且尚未生根的组培苗为材料，采用L9（34）正交试验研究不同浓度基本培养基、NAA、6-BA和香蕉对蝴蝶兰种苗生根培养的影响。每瓶接种3个材料，每个处理接种10瓶，3次重复，培养条件同“1.2.1”节，培养45 d后统计生根数、生根率，测量根长，筛选出适合蝴蝶兰小麻雀生根培养基。

1.2.4数据统计与分析

使用Excel 2010软件计算平均值，SPSS 18.0统计分析软件对数据进行方差分析（general linear model procedures）和多重比较（student-newman-keuls）。各指标计算公式为：增殖系数=增殖后芽数/接种外植体数[4]；平均叶片数=植株叶片总数/总株数；平均生根数=生根根数/生根不定芽数；生根诱导率=生根株数/接种株数×100%；平均根长=所有植株总根长/总株数[5]。

2结果与分析

2.1不同处理对蝴蝶兰原球茎增殖的影响

对9个正交处理组进行极差分析可知，A-6（1/2MS+8.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L蛋白胨）增殖系数最高，为262，A-1（MS+2.0 mg/L 6-BA）增殖系数最低，仅为1.33（表2）。由极差分析可知，基本培养基对增殖系数的影响较大，NAA浓度对增殖系数影响较小，4种因素对增殖系数的影响表现为基本培养基>6-BA浓度=蛋白胨浓度>NAA浓度。最适宜的蝴蝶兰小麻雀增殖的处理组合为1/4MS+8.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.5 g/L蛋白胨。通过组间效应检验可知，基本培养基（P=0002）、6-BA浓度（P=0.004）、蛋白胨浓度（P=0.007）对原球茎增殖系数的影响极显著，NAA浓度（P=0.277>0.05）对原球茎增殖系数的影响不显著。原球茎增殖形态如图1-A所示。

基本培养基、6-BA浓度和蛋白胨浓度对原球茎增殖培养的增殖系数的影响差异较大。MS与1/2 MS差异显著（P=0.029<005），MS与1/4 MS差异极显著（P=0.001<0.01），1/2MS、1/4MS间差异不显著（P=0.177>0.05）。可见，低浓度的无机盐有利于原球茎的增殖，当浓度高于1/2MS时对原球茎增殖产生抑制作用。2.0 mg/L 6-BA处理与 8.0 mg/L 6-BA处理差异极显著（P=0.003<0.01），5.0 mg/L 6-BA处理与8.0 mg/L 6-BA处理差异显著（P=0.022<0.05），2.0 mg/L 6-BA处理与5.0 mg/L 6-BA处理差异不显著（P=0.496>0.05）。说明在一定范围内，随着6-BA浓度升高，有利于原球茎增殖。0 g/L蛋白胨与 0.5 g/L 蛋白胨差异极显著（P=0.001<0.01），0 g/L蛋白胨处理与1.0 g/L蛋白胨差异显著（P=0.012<0.05），0.5 g/L 蛋白胨处理与1.0 g/L蛋白胨差异不显著（P=0.365>005），说明蛋白胨的参与对增殖有着明显影响，且在一定范围内低浓度的蛋白胨有利于原球茎增殖。

2.2不同处理对蝴蝶兰分化的影响

类原球茎增殖后，转入含有适当植物生长调节剂的分化培养基中，诱导类原球茎分化和植株再生（图1-B）。蝴蝶兰原球茎接种12 d后肉眼可见嫩绿色的新叶和绿色有绒毛的根。蝴蝶兰分化阶段，各处理叶长、叶宽无较大差异，其中第2组值最大，叶长4.99 cm，叶宽1.45 cm；第4组值最小，叶长4.44 cm，叶宽1.23 cm。9组处理原球茎都出现了分化现象，但生长情况不一，在后期生长过程中，B-1的叶片数最多，为3.63张；其次为B-8，平均叶片数为3.54张，叶片数最少的为B-7（2.68张）；平均株高最高为B-2组（4.17 cm），其次为B-8（4.04 cm），B-4组株高最低（3.21 cm）；而B-8的生根率和生根数均表现为最好，生根率达97.78%，生根数为2.2条（表3）。

通过组间效应检验可知，NAA浓度（P=0.000<0.01）对叶片数影响极显著，基本培养基（P=0.182>0.05）、6-BA浓度（P=0.735>0.05）、椰汁浓度（P=0.144>0.05）对叶片数的影响不显著；NAA浓度（P=0.008<0.01）对株高影响极

显著，基本培养基（P=0.032<0.05）对株高影响显著，6-BA浓度（P=0.069>0.05）、椰汁浓度（P=0.136>0.05）对叶片数的影响不显著；NAA浓度（P=0000<0.01）、基本培养基（P=0.003<0.01）对生根数影响极显著，椰汁浓度（P=0030<0.05）对叶片数的影响显著，6-BA（P=0.061>005）对生根数影响不显著；基本培养基（P=0243>0.05）、6-BA浓度（P=0.324>0.05）、NAA浓度（P=0.057>005）、椰汁浓度（P=0.916>0.05）均对生根率影响不显著。

2.3不同处理对蝴蝶兰生根的影响

可知，蝴蝶兰小麻雀生根培养的生根率在70%～100%，2 g/L花宝1号+0.05 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA+100 g/L香蕉的处理材料全部生根，生根数最多（352条）、根最长（35.37 cm）；1/2MS+0.3 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA+200 g/L香蕉生根数最少（1.24条），根长最短（5.75 mm）。根据各因素R值可知，4种处理因素对生根数影响的主次关系为NAA浓度>基本培养基>香蕉浓度>6-BA浓度。最适宜蝴蝶兰小麻雀生根数的组合为 2 g/L 花宝1号+0.05 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA+100 g/L 香蕉。4种处理因素对根长平均值影响的主次关系为NAA浓度>基本培养基>6-BA浓度>香蕉浓度，最适宜蝴蝶兰小麻雀根长的组合为1 g/L花宝1号+0.05 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA。

基本培养基（P=0.001<0.01）、NAA浓度（P=0.000<0.01）、香蕉浓度（P=0.001<0.01）对生根数影响极显著，6-BA浓度（P=0.380>0.05）对生根数的影响不显著；基本培养基（P=0000<0.01）、NAA浓度（P=0.000<0.01）、6-BA浓度（P=0.000<0.01）对根长影响极显著，香蕉浓度（P=0.924>0.05）对根长的影响不显著。1/2MS与1、2 g/L花宝1号（P=0.014<0.05）间生根数差异显著，1、2 g/L花宝1号之间差异不显著（P=0.899>0.05）。可见，花宝1号相较1/2MS培养基更有利于蝴蝶兰小麻雀生根培养，且在一定范围内，花宝1号浓度升高促进生根培养；0.05 mg/L NAA（P=0.000<0.01）、0.1 mg/L NAA（P=0.000<0.01）、0.3 mg/L NAA（P=0.000<0.01）三者之间差异极显著，根据估算边际均值得出，随着NAA浓度升高，生根数值降低，表明低浓度的NAA可以促进蝴蝶兰小麻雀的生根培养；0 g/L香蕉与100 g/L 香蕉（P=0.000<0.01）、200 g/L香蕉（P=0009<0.01）差异极显著，100 g/L 香蕉与200 g/L 香蕉（P=0159>0.05）差异不显著，添加香蕉可促进其生根培养。

3討论

在类原球茎的诱导阶段，李会珍的研究表明，添加低浓度6-BA、NAA对类原球茎的增殖和生长有利，1/2MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+10%香蕉+2%蔗糖为原球茎增殖最佳培养基，原球茎多，个大饱满，分散性好，低浓度6-BA有利于类原球茎增殖[6]，在改良KC、1/3MS、MS等3种基本培养基中，随着6-BA浓度的升高，增殖倍数呈降低趋势[7]。周俊辉的研究表明，高浓度（10～50 mg/L）6-BA有利于蝴蝶兰类原球茎增殖，较低浓度（0.1～0.5 mg/L）6-BA有利于蝴蝶兰类原球茎的分化；当6-BA使用浓度在 1.0～3.0 mg/L时，增殖情况无明显差异，NAA浓度对原球茎增殖分化影响不明显[8]。这可能跟试验品种或所选的基本培养基不同有关。本研究发现，低浓度的无机盐和蛋白胨有利于蝴蝶兰品种小麻雀增殖，高浓度的6-BA和附加一定浓度的蛋白胨有助于蝴蝶兰小麻雀的增殖。

添加细胞分裂素和生长素后对原球茎的分化有促进作用[9-10]。陈勇等认为，只添加激素0.1 mg/L NAA的 1/2MS 培养基适合原球茎分化，其分化率可达到100%，而在经常使用的高质量浓度NAA和低质量浓度6-BA组合对蝴蝶兰原球茎分化有一定的抑制作用；此外，相较于苹果汁、马钤薯汁

和香蕉泥，添加15%椰子汁的原球茎分化苗长势最佳[11]。聂菁等研究显示，添加3 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA，蝴蝶兰原球茎分化率最高，达96.67%[12]。王芳等认为，单独使用NAA时，NAA浓度与平均叶片数（0.2～3.0 mg/L）成正比，与6-BA配合使用时，低浓度的NAA促进叶片数的发生[13]。本研究发现，NAA在蝴蝶兰小麻雀分化阶段对叶片数和株高均有重要影响，并且在培养基中添加100 mL/L椰汁有利于丛生芽的分化与芽苗生长，且减轻了褐化现象。

培养基中添加NAA[14]、IBA[15]等激素有利于蝴蝶兰试管苗的试管壮苗。林宗铿等利用正交设计方法对蝴蝶兰生根壮苗的研究发现，与蔗糖、NAA和多效唑相比，无机营养是影响丛生芽发根率的主要因素，蝴蝶兰大粉红花杂交种（P. ‘New Eagle×P. ‘Happy Valentine）最佳生根壮苗培养基为 3.5 g/L 花宝1号+1 mg/L NAA+100 g/L香蕉泥+2 g/L蛋白胨+1 g/L活性炭+25 g/L蔗糖[16]。刘海姗研究表明，蝴蝶兰最适的生根培养基配方为1/2MS+2.0 mg/L 6-BA+05 mg/L IBA+20 g/L蔗糖；同时在继代过程中，可尝试将添加的细胞分裂素浓度高低交替使用，避免体内积累太多激素而影响生根效果[17]。本研究结果表明，NAA浓度对蝴蝶兰的生根数和根长有着重要的影响，花宝1号有利于蝴蝶兰小麻雀生根培养，香蕉泥的添加可促进蝴蝶兰生根培养，外源添加物能促进蝴蝶兰幼苗的生长和根系的发育，而香蕉泥的促进作用最为显著，这与张敏等的研究结果[18-19]一致，香蕉泥单独处理会促进根的生长，同时香蕉泥和椰汁的混合物为生根壮苗的最佳组合。

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