淮山多糖超声辅助提取及清除超氧阴离子自由基的作用

摘要：以无水乙醇为提取剂，采用超声辅助提取淮山中的多糖，设计L9（34）正交试验，研究超声功率、液料比、提取时间、提取温度对淮山多糖提取率的影响，并通过分光光度法分析淮山多糖清除超氧阴离子自由基能力。结果表明，淮山多糖的最佳提取工艺为超声功率800 W、液料比80 mL ∶[KG-*3]1 g、提取时间50 min、提取温度60 ℃，在此条件下淮山多糖提取率高达 8.53%。结果还表明，淮山多糖具有较好的清除超氧阴离子自由基的能力，且其清除能力与多糖浓度有明显的量效关系。

关键词：淮山；多糖；超声辅助提取；清除；超氧阴离子自由基

中图分类号： TS201.2文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）04-0144-03

淮山别称山药、怀山药，含有淀粉、多糖、尿囊素、胆碱等成分，药用价值极高，是药食两用的食品[1]。近年来，淮山多糖已被确定具有抗氧化功能[2]，有提高人体免疫功能和抗病能力[3]。超氧阴离子自由基（O-2[KG-*2]· [KG-*3]）是活性氧之一，具有强烈的氧化能力[4]。O-2[KG-*2]· [KG-*3]产生异常会损坏细胞，直接或间接导致机体衰老、炎症和癌症等某些疾病，因此对O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除的研究在医学保健中越来越重要[5]。

在淮山多糖提取方法中，最常见的有水提取法[6-7]、微波法[8-9]、酶解超声辅助提取法[10]。用水提取山药多糖成本低，不破坏生物活性，方便实用且安全性高，但耗时长、提取率不高。利用微波提取山药多糖具有高效快速的优点，但微波功率较难控制。酶与超声提取法使用的酶作为一种蛋白质，其酶解效果受酶解温度、pH值、底物浓度等多种因素影响，对提取会有干扰。超声波提取法主要利用超声波的空化作用产生热效应，机械作用加速细胞壁的破碎，促进细胞内多糖的溶出，达到缩短提取时间和提高多糖提取率的目的，还具有无需加热的优点。

本试验采用超声辅助提取淮山多糖，研究淮山多糖的最佳提取工艺。此外，通过分光光度法研究淮山多糖对超氧阴离子自由基的清除作用，分析其体外抗氧化活性，旨在为淮山的深度加工和综合开发利用提供一些参考依据。

1材料與方法

1.1材料、试剂与仪器

淮山购自贺州市阳光市场。所用化学试剂均为分析纯，试验用水为蒸馏水。可见分光光度计为722型（上海光谱仪器有限公司）。

1.2方法

1.2.1淮山多糖的超声辅助提取

将新鲜淮山洗净、去皮切片，60 ℃烘干后粉碎。称取干燥淮山粉末2.00 g，按设定试验条件进行超声波提取、离心，将上清液浓缩至15 mL，再加入60 mL乙醇，在冰箱冷藏室中放置24 h，离心，取沉淀，用乙[LM]醇洗涤后，再用蒸馏水溶解、稀释到合适的浓度，测定吸光度，按下式计算淮山多糖的提取率：

[JZ]提取率=C×V/m×100%。

式中：C为淮山多糖浓度，mg/mL；V为淮山多糖提取液的体积，mL；m为淮山粉末质量，mg。

1.2.2最优提取工艺条件的确定

在单因素试验的基础上，以超声功率、液料比、提取时间和提取温度为影响因素，以淮山多糖的提取率为指标，设计L9（34）的正交试验（表1）确定最优提取工艺。首先，分别称取5份2.00 g淮山粉末，固定液料比为60 mL ∶[KG-*3]1 g，超声时间为30 min，超声温度为60 ℃，分别研究400、600、800、1 000、1 200 W超声功率对淮山多糖提取率的影响。其次，在确定最佳超声波功率后，分别称取5份 2.00 g 淮山粉末，超声时间为30 min，固定超声功率为 800 W，超声温度为60 ℃，研究40 mL ∶[KG-*3]1 g、60 mL ∶[KG-*3]1 g、80 mL ∶[KG-*3]1 g、100 mL ∶[KG-*3]1 g、120 mL ∶[KG-*3]1 g的液料比对淮山多糖提取率的影响。在确定最佳超声波功率、液料比后，称取5份2.00 g淮山粉末，固定超声功率为800 W，液料比为80 mL ∶[KG-*3]1 g，超声温度为60 ℃，研究30、40、50、60、70 min提取时间对淮山多糖提取率的影响。在确定最佳超声波功率、液料比、提取时间后，分别称取5份 2.00 g 淮山粉末，固定超声功率为800 W，液料比为80 mL ∶[KG-*3]1 g，提取时间为50 min，研究40、50、60、70、80 ℃提取温度对淮山多糖提取率的影响。

1.2.3多糖含量的测定

称取0.100 0 g无水葡萄糖于烧杯中溶解，转移至100 mL容量瓶内，加水至刻度处，得 1.00 mg/mL 葡萄糖溶液。分别取0.40、0.60、0.80、1.00、120、1.40 mL 葡萄糖溶液于比色管中定容至25 mL，各取200 mL于试管内，加入1.00 mL 5%苯酚、5.00 mL浓硫酸，振荡，静置30 min，以试剂空白作为参比，于490 nm处测定吸光度D490 nm，绘制标准曲线，得回归方程y=9.483x+0.005，n=5，r=0.998 5。

1.2.4多糖对超氧阴离子自由基的清除

以分别加入 4.50 mL Tris-HCl缓冲溶液（0.05 mol/L，pH 值8.2）、2.00 mL H2O、0.20 mL HCl溶液（0.01 mol/L，pH值 8.2）的混合液作为参比溶液，以加入4.50 mL Tris-HCl缓冲溶液（0.05 mol/L，pH值8.2）、2.00 mL H2O、0.20 mL邻苯三酚溶液（0.05 mol/L）的混合液为空白溶液，以加入4.50 mL Tris-HCl 缓冲溶液（0.05 mol/L，pH值8.2）、不同浓度多糖溶液和0.20 mL邻苯三酚溶液（0.05 mol/L）的混合液作为样品液，振荡，最后加入1滴6 mol/L HCl终止反应，在37 ℃下加热10 min，冷却10 min至室温，在325 nm处测定吸光度D325 nm。计算多糖对 O-2[KG-*2]· [KG-*3]的清除率：清除率 =（D325 nm（0）-D325 nm（样））/D325 nm（0）×100%。式中：D325 nm（0）代表空白管所测的吸光度；D325 nm（样）代表不同浓度样品液所测得的吸光度。

2结果与分析

2.1超声功率对淮山多糖提取率的影响

在800 W功率范围内，淮山多糖提取率随着超声功率的增大而提高，在800 W时出现最高值，多糖提取率达8.5%；之后随着功率进一步增大，多糖提取率呈平稳下降趋势（图1）。这可能是超声功率的增加，加速了提取液的流动，使物料在超声场中停留的时间缩短，破壁作用减弱，胞内多糖溶出速率减缓，使多糖提取率降低[11]。因此，综合考虑最适宜的超声功率为800 W。

2.2液料比对淮山多糖提取率的影响

淮山多糖的提取率随液料比的增大而升高，当液料比为80 mL ∶[KG-*3]1 g时，淮山多糖的提取率基本达到最高值，之后随着液料比的增加提取率升高不明显（图2）。因此，最佳液料比为 80 mL ∶[KG-*3]1 g。

2.3提取时间对淮山多糖提取率的影响

淮山多糖的提取率随提取时间的延长而逐渐提高，当提取时间为50 min时，提取率基本达到最高值，之后随着提取时间的延长提取率变化不明显（图3）。因此，最佳提取时间为50 min。

2.4提取温度对淮山多糖提取率的影响

淮山多糖的提取率随提取温度的升高而提高，当提取温度超过60 ℃后，提取率升高不明显，可能因为过高温度会造成多糖黏稠，不易分离（图4）。因此，综合考虑认为适宜提取温度为60 ℃。

2.5正交试验

采用表1的L9（34）因素水平进行正交试验，以淮山多糖提取率为指标。由表2可知，影响淮山多糖提取率因素的顺序为A（超声功率）>D（提取温度）>B（液料比）>C（提取时间），即超声功率的影响最大，提取时间的影响最小。淮山多糖最优提取因素水平的组合为A2B3C2D1，即超声功率 800 W、液料比80 mL ∶[KG-*3]1 g、提取时间50 min、提取溫度60 ℃。

2.6验证试验

在最佳提取工艺条件下，即超声功率800 W、液料比 80 mL ∶[KG-*3]1 g、提取时间50 min、提取温度60 ℃，用相同方法提取5个样品，测定多糖提取率分别为8.52%、8.51%、853%、8.54%、8.55%，平均提取率为8.53%，表明该最佳提取工艺稳定可靠。

2.7本试验方法与其他方法的比较

通过与与其他提取淮山多糖方法（传统水提法、微波法、复合酶法）的比较，发现采用超声辅助提取淮山多糖的提取率最高，且提取时间比其他方法短（表3）。

2.8淮山多糖对超氧阴离子自由基的清除作用

当向邻苯三酚氧化体系中加入不同浓度的淮山多糖溶液时，吸光度会有所降低，由此可知淮山多糖能催化O-2[KG-*2]·与H+结合，从而降低体系中的超氧阴离子自由基含量。在反应过程中淮山多糖对O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率越高，表明对O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除作用越强。此外，淮山多糖具有较好的清除超氧阴离子自由基的能

3结论

通过单因素试验和正交试验确定淮山多糖的最优超声辅

助提取工艺：超声功率800 W、液料比80 mL ∶[KG-*3]1 g、提取时间50 min、提取温度60 ℃，在此条件下多糖提取率高达 8.53%，比传统水提法、微波法、复合酶法高，且提取时间也比这些方法短。因此，本试验结果将为淮山多糖提取及淮山多糖抗氧化作用研究提供理论参考，有望促进淮山资源的开发利用。

参考文献：

[1]雷伏贵，华树妹，涂前程，等. 山药种质资源亲缘关系的ISSR分析[J]. 福建农业学报，2013，28（1）：27-32.

[2]胡月芳. 毛细管电泳-电化学检测法测定淮山中5种活性成分[J]. 分析科学学报，2014，30（4）：533-536.

[3]盛玮，薛建平，谢笔钧. 怀山药零余子提取物抗氧化活性的研究[J]. 食品科学，2009，30（3）：92-94.

[4]王振，张立敏，田阳. 超氧阴离子自由基电化学分析的新进展[J]. 分析化学，2014，42（1）：1-9.

[5]姜招峰，何湘平，刘传缋，等. 超氧阴离子自由基诱导皮层神经细胞Cu/Zn SOD基因表达的研究[J]. 北京联合大学学报（自然科学版），2003，17（3）：9-11.

[6]赵卫星，姜红波，张来新，等. 山药多糖的提取测定研究[J]. 宝鸡文理学院学报（自然科学版），2010，30（3）：34-38.

[7]孙锋，谷文英，丁霄霖. 山药粗多糖的提取工艺[J]. 食品与生物技术学报，2006，25（3）：79-83.

[8]王安良，云霞，杨红. 响应曲面法优化山药中多糖的微波提取工艺[J]. 食品科技，2007，28（12）：86-90.

[9]余芳，朱秋红. 山药多糖提取纯化工艺研究进展[J]. 江苏调味副食品，2013（2）：13-16.

[10]葛立军，朱振洪，沙跃，等. 正交实验优化复合酶法提取山药多糖工艺研究[J]. 时珍国医国药，2010，21（12）：3187-3188.

[11]李金忠，马海乐，吴沿友. 超声波提取山药多糖的研究[J]. 粮油食品科技，2005，13（5）：14-15.[HT][HJ]