新疆维吾尔族宫颈鳞癌组织人乳头瘤病毒16型E6、E7基因变异分析

者湘漪 ，朱君玲 ，姜心雨 ，何鸿昌 ，潘贞贞 ,4，蒋琦伟 ，王媛 ，李洪涛 ，郑威楠 ，潘泽民 *

（1新疆地方与民族高发病教育部重点实验室/石河子大学医学院生物化学教研室，新疆 石河子 832002；2喀什地区第一人民医院病理科，新疆 喀什 844000；3石河子大学医学院临床医学系，新疆 石河子 832002；4新疆兵团第四师医院检验科，新疆 伊犁 835000）

宫颈癌在妇女最常见的恶性肿瘤中位居第三位，仅次于乳腺癌和结直肠癌。2012年全球宫颈癌新确诊 527，624例，死亡 265，653例[1]。我国宫颈癌患病率高，尤其在新疆维吾尔族妇女中，宫颈癌的发病率高达527/100000[2]。宫颈癌的发生涉及诸多因素，其中持续性感染高危型人乳头瘤病毒HPV16，已被公认为是引起宫颈癌，以及发展成为侵润性宫颈癌最主要的因素[3]。

宫颈癌的发展和进展涉及多种因素，大多数HPV16感染会在感染后一到两年内自动被免疫系统清除，只有一小部分HPV病毒感染发展成为宫颈癌[4-6]。HPV16作为宫颈癌最常见的高危型人乳头瘤病毒，促使发展成为宫颈癌的因素还不清楚。

基于HPV16E6基因区域单核苷酸多态性(SNPs)系统发育模式，可将HPV16定义为6个亚型：欧洲型(E)，亚洲型(As)，非洲 1 型（Af1），非洲 2 型（Af2），亚洲美洲型(AA)和北美型(NA)[7]。HPV16 谱系有地理区域集中分布现象，以及民族性差别。不同的HPV16亚型具有不同的致癌潜能，可能与某些重要序列位点突变有关[8-11]。然而，新疆维吾尔族宫颈癌HPV16亚型还鲜为人知。

人乳头瘤病毒HPV16 E6，E7基因编码的癌蛋白在HPV16介导的宫颈癌过程中持续表达，并且涉及多个信号通路[12]。已有研究表明，HPV16 E6，E7基因是研究HPV16疫苗很有前景的靶基因[13-14]。E6，E7基因多个位点突变影响HPV16病毒的抗原性，免疫原性以及易感性[5-6]。多项研究表明，非欧洲型的（non-European）病毒感染相比于欧洲型HPV16感染，更容易进展为高度鳞状上皮病变(HSIL)[15]。

本研究通过分析维吾尔族妇女宫颈癌HPV16病毒 E6，E7基因核苷酸序列，研究本地区HPV16亚型突变情况和分布特点，探讨HPV16E6，E7基因突变与新疆地区维吾尔族妇女宫颈癌高发的关系。

1 对象与方法

1.1 标本采集

采集喀什人民医院和乌鲁木齐自治区人民医院2011-2014年维吾尔族妇女宫颈鳞癌手术或活检样本（经病理检测确定为宫颈鳞癌），用HPV16 E6引物筛选出43例感染HPV16病毒的宫颈鳞癌样本。其中，20例为新疆南部维吾尔族妇女，23例为新疆北部维吾尔族妇女，患者均无外地长期居住史。样本于-80℃冻存。

1.2 DNA制备和HPV16病毒鉴定

DNA提取采用SK1252基因组DNA提取试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)，步骤按照试剂盒说明书操作。设计HPV16 E6引物，用PCR方法对样本进行HPV16病毒检测。鉴定HPV16 E6引物序列 HPV16E6-F：5’-GACCCAGAAAGTTACCACAG-3’，HPV16 E6-R：5′-CACAACGGTTTGTTGTATTG-3′（F：正向引物；R：反向引物）。

1.3 PCR扩增和测序

HPV16 E6，E7基因片段通过PCR技术进行扩增，PCR体系50 μL包含上下游引物各20 pmoles，50 mmol/L KCl，2.5 mmol/L MgCl2，100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，0.1%TritonX-100，50 μmmol/L dNTP，1.8 U HotStar Taq polymerase和5 μL DNA模版。PCR反应条件均为：94℃ 5 min;30个循环 55℃ 45 s，72℃60 s，94 ℃ 15 s，55 ℃ 45 s；72 ℃ 5 min。测序引物见表1。

表1 引物信息Tab.1 Information of primers

1.4 HPV16变异株进化学分析

PCR产物用SAP (Promega)和Exo I(Epicentre)进行纯化后，通过ABI Big-DyeTerminator v3.1 Cycle Sequencing Kit DNA分析仪(ABI3130XL，上海天昊生物医药科技有限公司)进行测序，用Polyphred软件对测序结果进行单核苷酸多态性（SNP）分析，以及和HPV16欧洲标准株 (GenBank:NC_001526.2)以及其它典型的HPV16变异株进行比较 (GenBank:AF472508;HQ644238)，AA (GenBank:AF402678) 和AA1(GenBank:HQ644247)。进化树通过软件MEGA 6构建（图 1）。

图1 HPV16 E6进化学分析Fig.1 Phylogenetic tree analysis of HPV16 E6 gene

1.5 GenBank登录号

本研究 HPV16 E6，E7基因测序序列在网站NCBIGenBank的登录号分别为E6:KT959524-KT959566，E7:KT966608-KT966650。

2 结果

2.1 HPV16 E6和E7基因的突变分析

43例患者全长的HPV16 E6，E7基因完成测序后序列与欧洲标准株相比较，基因变异位点（表2）。

表2 HPV16 E6,E7基因变异位点Tab.2 Nucleotide sequence variations in HPV16 of E6,E7

在E6，E7的测序结果中，共发现6个突变位点，4个为错义突变位点，2个为无义突变位点，分布在 E6基因的错义突变位点分别为T178G，T295G，T350G，A647G 位于E7基因，引起氨基酸改变分别为天冬氨酸→谷氨酸(D25E)，天冬氨酸→谷氨酸(D64E)，亮氨酸→缬氨酸(L83V)，天冬酰胺→丝氨酸(N29S)。两个无义突变均在E6基因，分别为nt 131，A →C，nt 96，G→A。HPV16 E6 最常见的突变位点是 T350G(34/43，79.1%)和 T295G(6/43，14.0%)。其中，T295G为一个新的突变位点，从未见报道。值得注意的是，6例T295G样本均存在T350G突变。与E6相比较，E7基因更保守，仅在一例样本的测序中发现A131C，T178G和A647G。

2.2 HPV16E6和E7的核苷酸序列进化树分析

E6进化学分析表明（图1），43例样本当中，只有XJ-5属于亚洲株，其余属于欧洲株，其中，有6例独立成一个分支，这与E6 T295G突变有关。E7进化学分析结果与E6的结果一致，只有XJ-5属于亚洲株，其余均为欧洲株（图2）。

图2 HPV16 E7进化学分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of HPV16 E7 gene

3 讨论

流行病学资料表明，相同的HPV类型的不同突变型具有生物学差异，可能会导致不同的致病风险[4]。因此，了解地区的HPV16变体的序列特征具有重要意义。多个研究报道，HPV16亚型在中国汉族女性中的分布高度相似，大多数为HPV16亚洲和欧洲型亚型[9，16-18]。但是，在维吾尔族妇女中HPV16亚型的分布还不清楚。我们的研究表明，新疆HPV16亚型最为普遍是欧洲株。相比之下，亚洲株普遍存在中国的其他地区，我们的结果没有观察到美洲-亚洲，中美洲，非洲亚型，维吾尔族妇女中亚洲株较少，这可能是因为维吾尔人的种族特征有关。结果提示，新疆维吾尔族妇女浸润性宫颈癌的感染和发展可能和欧洲株有关。43例样本包括HPV16欧洲原始株350T 8 例（8/43，18.6%），HPV16欧洲变异株 350G（L83V）34例（34/43，79.1%），亚洲变异株 1例（1/43，2.3%）。研究表明，HPV16 E6 L83V变种在摩洛哥妇女高度宫颈损伤中普遍存在，并且与宫颈癌的进展密切相关[19];该变体比HPV16欧洲原始株E6350T在宫颈疾病持续感染HPV16的妇女中以及宫颈癌的恶性进展中更为普遍[20-21]。此外，我们在HPV16欧洲株当中发现了6例新的核苷酸变异HPV16 E6T295G，以及350G共突变。我们的研究结果提示，T350G-T295G可能可以作为是HPV16欧洲变异株新疆变种对中国新疆HPV16变异型进行划分。

研究表明，E7与E6相比更保守[22-23]。我们发现只有一例A647G（N29S）突变，这是一个热点突变点，在亚洲女性中很常见。研究显示，韩国妇女宫颈癌中常见E7 N29S，并且增加了患宫颈癌的风险[17，24]。

我们的研究结果显示，在新疆维吾尔族妇女宫颈癌中HPV16欧洲变异株是最常见的类型，明显不同来自中国其他地方。未来的研究在扩大样本量的基础上结合细胞功能学实验来研究HPV16变体在宫颈癌发生发展中的作用。

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