响应曲面法优化高剪切分散乳化提取破布木果多糖

刘晓光，吴慧敏，王冲，于水，吴娟，李娇，张洁，谢建伟

（石河子大学化学化工学院/新疆兵团化工绿色过程重点实验室，新疆 石河子 832003）

维药破布木果（Cordia dichotoma Forst.f）系紫草科破布木属植物破布木的成熟干燥果实，维吾尔医认为破布木果具有生湿生热，成熟及清除异常黑胆质，润肺，润喉，止咳化痰，清音止渴，通便利尿的功效，主治干寒性或黑胆质性疾病[1]，但对胃和肝脏有害，矫正药为大枣或玫瑰花。目前有些临床广泛使用的方剂如祖卡木颗粒、降热比那甫西糖浆、热感赛比斯坦颗粒和益脑吾斯提库都斯糖浆等都以破布木果为主要药材。目前，国内外对破布木果化学成分的研究较少，而对于其多糖的研究目前还处于初始阶段[2]，朱明等[3]通过实验研究发现破布木果中含有丰富的多糖。因此，针对维药破布木果进行多糖的提取工艺研究可为破布木果下一步的开发利用打下基础。

多糖具有多种多样的生物活性，已经被国内外专家研究了近百年，多糖类物质不仅可以增强非特异性免疫，而且在降血糖、降血脂、抗癌方面也具有相当的生理活性[4-9]。目前多糖的提取方法有微波辅助提取、超声辅助提取、索氏提取等方法，但传统的提取方法往往存在溶剂消耗量大、提取时间长、提取效率低、操作不方便等弊端。高剪切分散乳化（High-speed shear dispersing emulsification，HSDE）是近些年来发展的一种新型的粉碎、分散、乳化和均质化的技术，广泛应用于制药业和食品工业[10-12]。高剪切分散乳化技术提供高剪切、空化和机械效应，使原料粉碎、分散、乳化和均质化，与微波辅助提取、超声辅助提取、索氏提取等传统的提取方法相比，高剪切分散乳化提取在提取速度、提取率、提取时间、能耗和操作上都具有明显的优势[13-16]。

本文研究采用高剪切分散乳化提取破布木果多糖，考察液料比、剪切时间、高剪切速度3个工艺参数，比较不同因素对破布木果多糖的率的影响，再采用响应面法进行工艺优化，应用 Design-Expert软件的Box–Behnken中心进行数据拟合[17-20]，探索高剪切分散乳化提取破布木果多糖的优化工艺条件，以期最大限度提取破布木果多糖，为破布木果多糖的进一步开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验试剂：破布木果购于乌鲁木齐奇康哈博维药股份有限公司，葡萄糖纯品购于天津富宇精细化工有限公司，蒽酮购于Sigma-Aldrich化学有限公司；其余试剂购于天津富宇精细化工有限公司，均为分析纯；实验所用水为双蒸水。

实验仪器：高速万能粉碎机（天宇机械有限公司），FLUKO FA25型高剪切分散乳化机（上海弗鲁克流体机械制造有限公司），DF-101S型电热恒温水浴锅（金坛市科析仪器有限公司），FA1104电子天平（上海越平科学仪器有限公司），Spectrumlab 752s型紫外-可见分光光度计（上海棱光技术有限公司），Eppendorf 5415D型离心机（德国艾本德公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 药材前处理

破布木果干燥果实经过万能高速粉碎机粉碎充分后，过40目筛，均匀混合，备用。

1.2.2 溶液配制

精密称取0.1 g蒽酮于50 mL容量瓶中，缓慢加入50 mL浓硫酸，混合摇匀，置于棕色瓶中，冰箱保存，便得到0.1% 硫酸-蒽酮溶液。因蒽酮容易被氧化，所以硫酸-蒽酮溶液只能现配现用。

葡萄糖标准品使用之前于105℃烘箱干燥，待其水分完全蒸发后，精密称取葡萄糖标准品100 mg于100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，待其完全溶解后，混匀，得到质量浓度为1.0 mg/mL的葡萄糖标准溶液。

1.2.3 比色体系试剂用量

1.2.3.1 反应温度的确定

用移液管精密吸取葡萄糖标准溶液1 mL于10 mL容量瓶中，用双蒸水定容，待其充分混合，得到0.1 mg/mL的葡萄糖溶液。用移液管分别移取5份上述溶液1 mL于具塞比色管中，在冰水浴中缓慢加入4 mL硫酸-蒽酮溶液，冰水浴冷却5 min后，分别于60、70、80、95、100 ℃的水浴中加热10 min，待其反应完全后，取出比色管，用自来水冲洗，待其冷却至室温后，放置10 min。以双蒸水为空白，用紫外-可见分光光度计在620 nm处测量吸光度，以确定最佳温度。

实验结果（图1）表明：随着温度升高，其吸光度逐渐增加，在 100℃时吸光度最大。所以本实验选用100℃水浴加热。

图1 温度对葡萄糖标准溶液显色的影响Fig.1 Effects of temperature on color reaction of glucose with it

1.2.3.2 硫酸-蒽酮用量的确定

用移液管精密吸取葡萄糖标准溶液1 mL于10 mL容量瓶中，用双蒸水定容，待其充分混合，得到0.1 mg/mL的葡萄糖溶液。用移液管分别移取5份上述溶液1 mL于具塞比色管中，在冰水浴中分别缓慢加入2、3、4、5、6 mL硫酸 -蒽酮溶液，冰水浴冷却5min后，于100℃的水浴中加热10 min，待其反应完全后，取出比色管，用自来水冲洗，待其冷却至室温后，放置10 min。以双蒸水为空白，用紫外-可见分光光度计在620 nm处测量吸光度，以确定最佳温度。

实验结果（图2）表明：随着硫酸-蒽酮用量的增加，吸光度随之增加，在4 mL时吸光度最大。因此本实验选用4 mL硫酸-蒽酮溶液。

图2 硫酸蒽酮用量对葡萄糖标准溶液显色的影响Fig.2 Effects of Sulfuric acid-anthrone reagent amount on color reaction of glucose with it

1.2.3.3 反应时间的确定

用移液管精密吸取葡萄糖标准溶液1 mL于10 mL容量瓶中，用双蒸水定容，待其充分混合，得到0.1 mg/mL的葡萄糖溶液。用移液管分别移取5份上述溶液1 mL于具塞比色管中，冰水浴中缓慢加入4 mL硫酸-蒽酮溶液，冰水浴冷却5 min后，于100℃的水浴分别中加热 5、10、15、20、25 min，待其反应完全后，取出比色管，用自来水冲洗，待其冷却至室温后，放置10 min。以双蒸水为空白，用紫外-可见分光光度计在620 nm处测量吸光度，以确定最佳温度。

实验结果（图3）表明，随着反应时间延长，吸光度随之增加，在10 min后吸光度无明显变化，因此本实验选用加热时间为10 min。

图3 反应时间对葡萄糖标准溶液显色的影响Fig.3 Effects of reaction time on color reaction of glucose with it

通过以上实验可以确定硫酸-蒽酮法测多糖含量的条件为：反应温度为100℃，待测液∶硫酸-蒽酮溶液=1∶4（V∶V），反应时间为10 min。

1.2.4 葡萄糖标准曲线的绘制

用移液管分别移取 0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL葡萄糖标准溶液于100 mL容量瓶中，用双蒸水定容，充分混合，静置20 min。用移液管分别移取上述溶液1 mL于具塞比色管中，在冰水浴中缓慢加入4 mL硫酸-蒽酮溶液，冰水浴冷却5 min后，加入沸水浴中10 min，待其反应完全后，取出比色管，用自来水冲洗，待其冷却至室温后，放置10 min。以双蒸水为空白，用紫外可见分光光度计在620 nm处测量吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。得到标准曲线方程为：y=0.0696x+0.0017，相关系数R2=0.9989。利用标准曲线计算破布木果中多糖的公式如下所示（以葡萄糖计算）。其结果见图1-4。

式中：Y为多糖得率（得率单位为mg/g，以葡萄糖计算，浓度单位为μg/mL），y为所测样品的吸光度，m为所称取破布木果质量（单位为g）。

图4 葡萄糖标准曲线Fig.4 Standard curve of glucose

1.2.5 单因素试验设计

为了探究不同因素对破布木果多糖提取的影响，设计了液料比、剪切速度、剪切时间3种不同的因素，每个因素设置了5或6个不同的水平，以找出各个因素的适应范围。考虑到实际操作的便利，我们固定溶液体积为140 mL。

1.2.5.1 液料比对多糖得率的影响

分别称取破布木果粉末 14.0、7.0、4.67、3.5、2.8 g和 2.3 g，其对应的液料比（mL/g）分别为 10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1，加入 140 mL 蒸馏水，剪切速度为13000 r/min，剪切时间2 min，剪切完成后，静置10 min，后用离心机10000 r/min离心3 min，采用Sevag法除蛋白，上层是水，中层是蛋白，下层是有机层，分离出上层，其中多糖溶液位于上层。用移液管分别移取1 mL不同液料比的溶液，于具塞比色管中，在冰水浴中缓慢加入4 mL硫酸-蒽酮溶液，冰水浴冷却5 min后，加入沸水浴中10 min，待其反应完全后，取出比色管，用自来水冲洗，待其冷却至室温后，放置10 min。以双蒸水为空白，用紫外可见分光光度计在620 nm处测量得到相对应的吸光度，利用标准曲线方程计算多糖含量。

实验结果（图5）表明：随着蒸馏水的增加，破布木果多糖的提取量也随之增加，当增加到液料比为50∶1时，多糖的得率最高，随后呈下降趋势。

图5 液料比对多糖得率的影响Fig.5 Effect of liquid-solid ratio on polysaccharide content

1.2.5.2 剪切时间对多糖得率的影响

称取破布木果粉末6份，每份2.8 g（液料比为50∶1），加入140 mL蒸馏水，剪切速度为13000 r/min，剪切时间分别为 1、2、3、4、5、6 min，剪切完成后，静置10 min，后用离心机10000 r/min离心3 min，采用Sevag法处蛋白，上层是水，中层是蛋白，下层是有机层，分离出上层，其中多糖溶液位于上层。用移液管分别移取1 mL不同剪切时间的溶液，于具塞比色管中，实验步骤如1.2.5.1所示。

实验结果（图6）表明：随着剪切时间的延长，破布木果多糖的得率也随之增加，在3 min时，得率是最高的，随后多糖的率呈下降趋势。究其原因可能是：时间越长，产生越多的热而使多糖降解。

图6 剪切时间对多糖得率的影响Fig.6 Effect of treatment time on polysaccharide content

1.2.5.3 剪切速度对多糖的率的影响

准确称取5份破布木果粉末2.8 g，固定其液料比为 50∶1，加入140 mL蒸馏水，探究在不同剪切速度下多糖得率的影响。由于高剪切分散乳化机只能设 置10000、13000、16000、19000、22000r/min，所以只选用这5个水平。每组剪切3 min，剪切完成后，静置10 min，后用离心机10000 r/min离心3 min，采用Sevag法处蛋白，上层是水，中层是蛋白，下层是有机层，分离出上层，其中多糖溶液位于上层。用移液管分别移取1 mL不同剪切速度的溶液，于具塞比色管中，实验步骤如1.2.5.1所示。

实验结果（图7）表明：随着剪切速度的增加，破布木果多糖的得率也随之增加，在剪切速度为16000 r/min时，得率是最高的，随后多糖的率呈下降趋势。究其原因可能是：由于剪切速度加快增加了机械摩擦，从而产生更多的热量使多糖降解。

图7 剪切速度对多糖得率的影响Fig.7 Effect of HSDE rotary speed on polysaccharide content

2 结果与分析

2.1 响应曲面法实验设计方案

根据以上单因素试验的结果，根据响应曲面法Box-Behnken中心组合原理，选取液料比、剪切时间和剪切速度 3个因素（分别用X1，X2，X3表示），破布木果多糖得率为响应值，利用Design-Expert 8.0软件进行3因素3水平实验设计与分析，实验因素与水平见表1。

表1 响应曲面分析因素与水平设计表Tab.1 Factors and levels in the response surface design

2.2 响应曲面模型建立与结果分析

以液料比（X1）、剪切时间（X2）和剪切速度（X3）为自变量，多糖得率（Y）为响应值，建立响应曲面模型，进行响应曲面实验分析，实验值与预测值相差不是很大，实验方案及实验结果见表2。

表2 响应曲面设计方案与实验结果Tab.2 Program and experimental results of RSM

2.3 响应曲面方差分析

以液料比（X1）、剪切时间（X2）和剪切速度（X3）为自变量，多糖得率（Y）为响应值，进行响应曲面二次回归方差分析。从实验方差分析结果（表3）可知：

（1）所选用的模型P<0.0220（显著），失拟项P=0.3154>0.05（不显著）。表明该回归模型的拟合很好，实验值与预测值比较接近。

（2）自变量与响应值之间线性关系差异系数R2=0.8667，调整系数R2=0.6954。表明模型拟合程度较好，能够用来描述实验结果。

（3）该模型的信噪比为7.177>4，表明该模型能够得到很强的响应信号，并且只有6.62%的变异系数。说明该模型的重现性很好，因此可以采用该模型分析和预测破布木果多糖提取工艺结果。

表3 响应曲面回归模型方差分析表Tab.3 ANOVA for response quadratic model

2.4 响应曲面图与最佳提取工艺

各因素之间相互影响的响应曲面及等高线图见图8。

图8 响应曲面及等高线图:剪切时间3 min，液料比与剪切速度对多糖得率的影响(a)；剪切速度16000 r/min，液料比与剪切时间对多糖得率的影响（b）；液料比50 mL/g，剪切速度与剪切时间对多糖得率的影响（c）Fig.8 Responsive surfaces and contours：effect of liquid-solid ratio and speed on polysaccharides yield with rotary time 3min(a);effect of liquid-solid ratio and time on polysaccharides yield with rotary speed 16000 r/min(b);effect of rotary speed and time on polysaccharides yield with liquid-solid ratio 50 mL/g(c)

从图8可知：随着自变量因素的增大，其对应的响应值也随之增大，当响应值增大到极值后，随着自变量因素的增大，响应值呈逐渐减小趋势。通过响应曲面实验设计的结果可知，在高剪切分散乳化提取破布木果多糖实验中，各因素影响顺序为液料比（X1）> 剪切时间（X2）> 剪切速度（X3），提取破布木果多糖最佳工艺条件为：当液料比为54.15∶1（mL：g），剪切时间为3.23 min，剪切速度为15823.94 r/min，多糖得率预测值为111.543 mg/g。

为了方便实际操作及方法的可靠性，平行重复3次进行验证试验，将上述最佳工艺条件简化为：液料比50∶1（mL∶g），剪切时间 3.0 min，剪切速度16000 r/min，破布木果多糖得率平均值为（111.43±0.1）mg/g。上述最佳工艺条件结果与预测值接近，说明此响应曲面法得到的回归模型具有一定的可靠性，能较好预测破布木果多糖提取的得率。

3 结论

（1）采用响应曲面法优化高剪切分散乳化提取破布木果多糖，并建立了多元回归模型，模型拟合程度良好。

（2）经Design-expert8.0软件分析，破布木果多糖的最佳提取工艺条件为：液料比为 50∶1（mL∶g），剪切时间为3.0 min，剪切速度为16000 r/min，破布木果多糖得率为（111.43±0.1） mg/g。

（3）高剪切分散乳化技术操作简单，效率高，可用于提取天然产物有效成分的研究，具有较好的应用前景。

参考文献：

[1] 刘勇民，等.维吾尔药志（上册）[M].乌鲁木齐:新疆人民出版社，1986:663-665.

[2] 田树革.异常黑胆质成熟剂及其组方药材破布木果质量控制与体外活性研究 [D].乌鲁木齐：新疆医科大学，2013:67-115.

[3] 朱明，欧亮苗，田树革，等.破布木果提取物对小鼠淋巴细胞的增殖作用[J].新疆医科大学学报，2015，1(38):36-43.Zhu M，Ou L H，Tian S G，et al.Proliferative effects of extracts from Cordia dichotoma seeds on spleen lymphocytes in mice[J].Journal of Xinjiang Medical University，2015，1(38):36-43.

[4] Kumazawa Y，Mizunoe K，Otsuka Y，et al.Immunostimulaing polysaccharide separated from water angelica acutiloba Kitagawa(Yamato Tobki)[J].Immunology，1982，47(1):75-83.

[5] Chao C H，Mei Q B，Shang P，et al.Study of the gastrointestinal protective effects of polysaccharides from Angelica sinensis in rats[J].Planta Medical，2000，66(4):348-351.

[6] Hosein R，Seyed M，Taghi G，et al.Microwave-assisted extraction of jujube polysaccharide:optimization，purification and functional characterization[J].Carbohydrate Polymers，2016，143:100-107.

[7] Xu Y Q，Cai F，Yu Z Y,et al.Optimisation of pressurised water extraction of polysaccharides from blackcurrant and its antioxidant activity[J].Food Chemistry，2016，194:650-658.

[8] 廉宜君，刘红，李炳奇，等.甘草渣多糖的大孔树脂分离纯化及抗氧化活性的研究 [J].石河子大学学报（自然科学版），2015，33(3):352-356.Lian Y J，Liu H，Li B Q，et al.Purification of polysaccharides from Licorice Residue by macroporous resins and investigation of its antioxidant activity[J].Journal of Shihezi University（Natural Science），2015，33(3):352-356.

[9] 马英，田丽萍，高婷婷，等.新疆芍药与窄叶芍药根中多糖含量测定及体外抗氧化活性的研究[J].石河子大学学报:（自然科学版），2014，32(5):573-577.Ma Y，Tian L P，Gao T T，et al.The study on determination and antioxidant activity of polysaccharide between P.sinjiangensis and P.anomala root[J].Journal of Shihezi University（Natural Science），2015，33(3):352-356.

[10] 滑聚娜，冯祖飞，刘永峰，等.基于高剪切分散乳化技术的黄芪中黄酮类化合物提取方法及动力学研究 [J].分析化学，2012（5）:752-756.Hua J N，Feng Z F，Liu Y F，et al.Study on extraction method and kinetics of flavonoids in astragalus membranaceus based on high-shear dispersion emulsification technology[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry，2012，（5）:752-756.

[11] 张彩猛，华欲飞，孔祥珍，等.高速剪切对醇法大豆浓缩蛋白溶解特征的影响[J].大豆科学，2010，5(29):853-857.Zhang M C，Hua Y F，Kong X Z，et al.Effect of highspeed cut treatment on characteristic of alcohol washed soybean protein concentrates[J].Soybean Science，2010，5(29)：853-857.

[12] 李丽，卜令娜，刘晔伟，等.高速剪切技术提取油菜蜂花粉总黄酮工艺[J].食品工业科技，2012，13(33):285-288.Li L，Piao L N，Liu Y W，et al.Study on extraction process of total flavonoids of rape bee pollen by highspeed shearing technique[J].Science and Technology of Food Industry，2012，13(33):285-288.

[13] 李丽，刘晔玮，赵剑喜，等.高速剪切技术破碎油菜蜂花粉细胞壁工艺[J].食品科学，2012，12(33):97-101.Li L，Liu Y W，Zhao J X，et al.High-speed shear treatment for cell wall disruption of rape bee pollen[J].Food Science，2012，12(33):97-101.

[14] 邸羿，刘永峰，孙小明，等.高剪切分散乳化技术提取茶叶中有效成分的动力学及热力学研究 [J].分析测试学报，2013，4(32):401-407.Di Y，Liu Y F，Sun X M，et al.Study on kinetics and thermodynamics of active ingredients in tea leaves based on high shear dispersing emulsification technology[J].Journal of Instrumental Analysis，2013，4(32):401-407.

[15] 樊梓鸾，林秀芳，王丽，等.响应面法优化高剪切分散乳化提取悬钩子多酚[J].食品与生物技术学报，2014，4(33):355-360.Fan Z L，Liu X F，Wang L，et al.High-speed shear treatment for extraction of polyphenol from raspberries via response surface optimization[J].Journal of Food Science and Biotechnology，2014，4(33):355-360.

[16] Wang C，He X W，Fu X，et al.Highspeed shear effect on properties and octenylsuccinic anhydride modification of corn starch[J].Food Hydrocolloids，2015，44:32-39.

[17] Li D Q，Jia X，Liu Z Y，et al.Box–Behnken experimental design forinvestigation ofmicrowave-assisted extracted sugar beet pulp pectin[J].Carbohydrate Polymers，2012，88:342-346.

[18] Photene K，Evdokea V，Spyros G，et al.A green ultrasoundassisted extraction process for the recovery of antioxidant polyphenols and pigments from onion solid wastes using Box–Behnken experimental design and kinetics[J].Industrial Crops and Products，2015，77:535-543.

[19] 邓小丽，秦冬梅，陈文，等.星点设计优化丙酸氟替卡松鼻用温敏凝胶处方并对其体外释放及滞留性进行考察[J].石河子大学学报（自然科学版），2017，35(1):120-123.Deng X L，Qin D M，Chen W，et al.Optimization of the formulation of fluticasone propionate thermosensitive in-situ Gel nasal drops by central composite design-response surface methodology and investigation of vitro release retention[J].Journal of Shihezi University（Natural Science），2017，35(1):120-123.

[20] 姜玉柳，龚晓武，呼肖娜，等.响应曲面法优化酸/盐催化玉米芯产糖的工艺[J].石河子大学学报(自然科学版)，2015，33(5):629-632.Jiang Y L，Gong X W，Hu X N，et al.Optimization of Hydrolysis Conditions ofCorn Cob in the Presence of Acid/Salt Catalysts for Fermentable Sugars by Using Response Surface Methodology[J].Journal of Shihezi University（Natural Science），2015，33(5):629-632.