围绝经期大鼠外周血调节性T淋巴细胞的改变及缝隙连接蛋白40的表达

付睿婷 ，彭珉 ，马克涛 ，李丽 ，司军强

（1石河子大学医学院生理学教研室/新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，新疆 石河子832002；2石河子大学医学院第一附属医院妇产科，新疆 石河子 832000）

围绝经期是指围绕绝经的一段时期，包括从接近绝经出现与绝经有关的内分泌、生物学和临床特征起至最后一次月经后一年内的时期，由于性激素水平变化（雌激素E减少）可能出现以植物神经功能紊乱、代谢障碍为主的一系列躯体及精神心理症状[1]，并且会出现免疫系统功能逐渐衰退的现象[2]。近年研究提示，女性雌激素水平与免疫调节密切相关，不同剂量的雌激素水平可引起不同的免疫应答[3]，既往相关研究多是围绕研究围生期女性较多，对于围绝经期女性的相关研究较少。随着我国进入老龄化社会，逐步步入围绝经期的女性越来越多，对身体素质、生活质量提高的要求也越来越广泛而迫切，故而内分泌免疫调节日益受到重视。因为雌激素是具有广泛调节作用激素之一，与免疫系统、感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等的发生率等都密切相关，所以颇受注目。绝经妇女雌激素水平下降，对T淋巴细胞亚群的相对和绝对数量有一定的影响[4-5]，这一过程是通过性激素受体途径把相关信息传递给免疫系统来改变外周血T淋巴细胞亚群[6]。Holl在对绝经后妇女细胞免疫的研究中发现，使用激素替代治疗(HRT)后CD8+细胞明显减少，CD4+/CD8+的值增高[7]；McMurray等的研究发现E可抑制活化的外周血T细胞和CD4+T细胞系IL-2在转录水平的表达[8]；研究结果显示，围绝经期综合征患者的血清IL－1β、IL－6、TNF-α 浓度明显高于对照组[9]，这些研究说明随着围绝经期综合征的发生伴有免疫细胞激活[3,10]。雌激素对免疫功能的调节作用已经成为妇科内分泌学的研究热点。

缝隙连接作为相邻细胞间物质交换的直接通路，其组成的基本单位是连接蛋白。近年研究表明，缝隙连接蛋白在外周血T、B及自然杀伤(natural killer，NK)细胞中也表达[10]。外周血T淋巴细胞亚群是反应机体细胞免疫功能的重要指标，其中CD4+T细胞和CD8+T细胞是T淋巴细胞的主要亚群。Cx40介导缝隙连接参与免疫系统细胞间细胞通讯[11,12]及免疫炎症应答。当免疫细胞受到炎症因子的刺激，Cx40表达上调[13-14]。因此，缝隙连接可能参与围绝经期妇女的免疫炎症应答及免疫系统细胞间通讯。但有关T淋巴细胞间Cx40的表达与围绝经期妇女免疫的研究尚不清楚。因此，本实验将以SD雌鼠围绝经模型为研究对象，应用流式细胞术和ELISA技术，旨在研究在围绝经状态下外周血T淋巴细胞间缝隙连接蛋白Cx40的表达和炎症因子的分泌变化并探讨其相应机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

实验动物 取16周龄雌性SD大鼠18只，SPF级，体重200～300 g(新疆自治区疾病控制中心提供，许可证编号SCXK 新 2011-0001)。适应性饲养1周后进入正式实验，动物房室内温度和湿度分别控制在20℃和50%左右。各组大鼠分笼喂，给予标准饲料，自由进食水，环境安静。所有实验在符合动物实验伦理要求下进行。

实验试剂 异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的小鼠抗大鼠CD3抗体(CD3-FITC)、FITC标记的IgG1同型对照、别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)标记的小鼠抗大鼠CD4抗体(CD4-APC)、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记小鼠抗大鼠CD8a(CD8a-PE)、PE标记的小鼠抗大鼠CD4抗体(CD4-PE)、PE标记的IgG1同型对照、PE标记的IgG2a同型。对照均购自BioLegend公司，兔抗大鼠Cx40抗体购自SantaCruz公司，FITC标记的山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物科技有限公司，大鼠IL-1、IL-2、IL-6 ELISA试剂盒均购自杭州联科生物有限责任公司，红细胞裂解液购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。4℃高速离心机为安徽中科中佳科学仪器有限公司产品；流式细胞仪为深圳迈瑞公司产品；

1.2 围绝经大鼠模型的制备

女性雌激素90%由卵巢分泌，摘除卵巢，切断其来源，可人为地造成雌激素突然降低的环境，来模拟围绝经期综合征。随机取SD雌性大鼠9只，麻醉后取最末肋骨下、腋中线和距脊柱外侧约2 cm交叉处，剪除长毛，切开皮肤和背肌约1.5 cm，将卵巢用丝线结扎，摘除卵巢。术后5 d起，对动物进行阴道涂片检查，1次/d，连续 5 d，以不出现动情期反应为造模成功。

1.3 方法

1.3.1 T淋巴细胞亚群和Cx40检测

大鼠麻醉状态下，采集腹主动脉外周血，置10 g/L EDTA真空采血管内。取100 μL新鲜外周血，洗涤2000 r/min离心5 min，弃上清；100 μL PBS重悬细胞，分别加入相应流式抗体(CD3-FITC，FITC同型对照；CD4-APC，APC 同型对照；CD8-PE，PE 同型对照；兔抗大鼠Cx40抗体和FITC标记的山羊抗兔IgG，FITC同型对照)1 μL，并设立阴性对照。室温避光孵育30 min，加入2 mL红细胞裂解液裂解红细胞，室温避光孵育10 min；加入PBS 2 mL稀释，1000 r/min离心5 min，弃上清；PBS重悬细胞至终体积为250 μL，上机使用CELLQuest软件进行检测。

1.3.2 炎症因子检测

采集大鼠内眦动脉外周血2 mL于EDTA抗凝管中，2000 r/min离心5 min，取血浆层于-80℃保存。采用ELISA检测IL-1、IL-2和IL-6的水平。操作步骤按照说明书操作。

1.3.3 统计学分析

应用SPSS18.0统计软件进行分析，实验结果数据以±S表示。两组间比较方差齐性者采用两样本均数t检验，方差非齐性者采用近似t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组大鼠和OVX组大鼠外周血中T淋巴细胞亚群的表达

流式细胞术检测结果显示，与对照组相比，OVX组大鼠外周血中CD3+和CD4+T淋巴细胞分别下降13.24%和 22.5%（P<0.05），CD8+T淋巴细胞比例上升29.8%（P<0.05），CD4+/CD8+降低（P<0.01）(表 1)。

表1 对照组大鼠和OVX组大鼠外周血中T淋巴细胞亚群的表达 ±S，n=9Tab.1 Expression of T lymphocyte subsets in peripheral blood of control group SD rats and Ovx group SD rats

表1 对照组大鼠和OVX组大鼠外周血中T淋巴细胞亚群的表达 ±S，n=9Tab.1 Expression of T lymphocyte subsets in peripheral blood of control group SD rats and Ovx group SD rats

注：*P<0.05，OVX 组 vs对照组。**P<0.01，OVX 组 vs对照组。

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2.2 对照组大鼠和OVX组大鼠外周血中T淋巴细胞亚群Cx40的表达

流式细胞术检测结果显示，Cx40在OVX组CD4+T淋巴细胞的表达高于对照组（6.54%±1.75%vs 4.01%±2.51%，P<0.05），Cx40在 OVX组CD8+T淋巴细胞的表达高于对照组（18.3%±5.53%vs 8.05%±4.17%，P<0.01）（图 1）。

图1 两组大鼠外周血T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+上CX40的表达频率 n=9Fig.1 Expression of Cx40 in the CD4+and CD8+T lymphocytes in peripheral blood of the two groups

2.3 对照组和OVX组大鼠外周血中IL-1β、IL-2、IL-6表达水平

检测结果显示，OVX组与对照组相比，IL-2水平下降（P<0.05），IL-6水平升高（P<0.01）IL-1β 的差异无统计学意义（表2）。

表2 对照组和OVX组SD大鼠外周血中IL-1β、IL-2、IL-6表达水平比较 X±S，n=9Tab.2 Comparison of IL-1β，IL-2 and IL-6 levels in peripheral blood of control and OVX group

3 讨论

围绝经期由于卵巢分泌雌激素减少导致全身各系统和器官的组织结构及功能影响，免疫应答受损害，机体应对各种压力因素的能力全面降低和伴随的促炎状态的逐步增加，此时期可被称为“炎症性衰老”[15]，此时期伴随着机体慢性雌激素缺乏及慢性炎症。围绝经期免疫系统的衰老比较典型的反映了机体的老化过程[16]，免疫衰老过程同时影响到先天免疫系统和后期适应性免疫系统[17-18]。年龄较大的人群常常被观察到T细胞减少，胸腺原始T细胞的衰竭消耗[19]，B细胞下降，反映体液免疫有缺陷[20]，以及慢性炎症[21]。因此，年龄较大的受试者对感染不易免疫，受感染后的机体反应比年轻人大[22]，比年轻人更容易受到病毒和细菌感染，机会性感染，潜伏病毒，自身免疫疾病等的影响[23-24]。

外周血T淋巴细胞亚群是反应机体细胞免疫功能的重要指标，且T细胞增殖能力的明显降低是老龄化的重要标志之一。Ferguson[25]提出老年人的T细胞增殖潜能较年轻人低是与其对病原体抵抗力低相关。CD4+T细胞和CD8+T细胞作为主要的两个细胞亚群，相互协调，相互制约，共同参与维持免疫系统的平衡。正常的CD4+/CD8+T细胞比值约为1.5～2.0。若T细胞总数或CD4+/CD8+T细胞比值发生改变，即可视为免疫调节功能异常[26]。国外很多学者采用去卵巢大鼠模型来模拟围绝经期的发生来进行相关试验的研究，前人研究结果显示，去卵巢大鼠 T淋巴细胞免疫功能衰退，导致CD3+、CD4+减少CD8+增加[27]。Huppert等[28]报道随增龄外周血所有的淋巴细胞亚群的均值均趋于降低，并具有明显的性别差异，女性比男性的值要低。本研究中发现OVX组大鼠外周血中CD4+T淋巴细胞比例较对照组显著降低，CD8+T淋巴细胞比例显著升高，CD4+/CD8+比值明显降低，进一步说明雌激素降低后出现机体免疫系统的紊乱。

细胞因子是具有高效性、多向性、内生性的小分子多肽，主要参与调节机体的免疫应答、造血功能和炎症反应等。白细胞介素是细胞因子的一种。研究发现退变的椎间盘组织能够产生大量的炎症因子，其中 IL-1β是一种能导致炎症反应及细胞凋亡的多效性细胞因子，在椎间盘细胞凋亡中起重要作用，17β-雌二醇可有效抑制 IL-1β诱导的大鼠纤维环细胞凋亡，并且这种作用具有浓度依赖性[29]。本研究中OVX组IL-1β水平与对照组相比升高，但无统计学意义，这可能和检测手段不同而有所差异。Mc Murray RW等[8]动物实验发现，长期低剂量的（绝经后浓度）E2能抑制外周血活化的T细胞生成IL-2和IL-2R。有动物实验显示生理浓度的E2可下调血清中IL-6；而人卵巢切除术后或自然绝经后，外周血及骨髓中单核细胞产生的IL-6增多，E2治疗能降低IL-6的产生[22]。本研究结果显示，OVX组大鼠与Control组相比血清IL-2水平下降，IL-6水平升高，说明围绝经期雌鼠性激素失调可影响免疫系统，导致促炎因子释放增加，雌激素下降促使单核细胞增生导致血液IL-2减少而IL-6增多，这与凌晨等的研究结果相一致[30]。

近年来发现炎症环境下淋巴细胞亚群的变化与缝隙连接蛋白的表达有关。缝隙连接是细胞表面小于1kDa的小分子和离子在细胞间直接转运的专门的通道。每个细胞间通道单元是由一对在协同细胞间相互作用的半通道构成的。缝隙连接蛋白除了分化的骨骼肌、红细胞和成熟的精子细胞，几乎在所有组织中都有表达。在淋巴细胞上主要表达Cx43，而主要在来自次级淋巴器官的淋巴细胞上表达Cx40[18]。有研究结果确定缝隙连接蛋白是调节免疫过程的重要细胞表面成分[31]。前期我们研究发现应用特异性的缝隙连接阻断剂Gap27能够显著抑制T淋巴细胞释放炎症因子，提示缝隙连接在T淋巴细胞介到的炎症反应中发挥了重要的作用[32]。用植物血细胞凝集素（PHA43）和脂多糖（LPS）炎性条件下分别刺激T和B淋巴细胞可增加其CX40及CX43蛋白的表达[33]。

不仅是炎症因子对缝隙连接蛋白的表达有影响作用，大量研究表明雌激素也参与缝隙连接蛋白的表达。在前人的研究中，发现绝经后大鼠心脏传导阻滞，结果显示绝经后大鼠心肌间隙连接受损，而连接蛋白 43（Cx43）表达减少，在卵巢切除后的（OVX）大鼠上也观察到这种现象，其可以通过E2补充来改善这一情况[34]。有研究表明，使用给予7天龄的新生雄性大鼠皮下注射雌二醇苯甲酸酯（EB），在4个月龄时通过定量实时PCR检测附睾中Cx亚型的表达变化，发现低剂量 EB的治疗导致 Cx32，Cx37和Cx45转录水平升高，而高剂量EB的治疗则降低了Cx26，Cx30.3，Cx31，Cx31.1，Cx32，Cx40，Cx43 和 Cx45的表达[35]。说明缝隙连接蛋白40的表达受机体雌激素水平高低的影响。在本研究中，发现OVX组CD4+，CD8+淋巴细胞亚群所表达的Cx40较 Control组均升高，进一步说明了机体处于低雌激素情况下，缝隙连接蛋白40的表达发生改变。

通过本研究我们发现，围绝经期大鼠由于雌激素降低，机体处于慢性炎症环境，免疫紊乱，T淋巴细胞亚群比例下降，缝隙连接蛋白40在外周血CD4+、CD8+上的表达升高，说明缝隙连接蛋白的表达与雌激素水平高低密切相关，并且有可能参与围绝经期免疫应答过程。

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