阿尔茨海默病患者血液差异表达microRNA的生物信息学分析

董洪昌，王娜，黄瑾

（石河子大学医学院生化教研室/新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，新疆 石河子832002）

阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一种神经系统退行性疾病，主要以进行性记忆损害、认知功能下降、行为改变以及语言障碍为主要临床表现，是老年痴呆中最常见的类型，主要病理改变是老年斑和神经元纤维缠结的形成[1]。根据2016年《世界阿尔茨海默病报告》，截止到2016年，全球有四千七百万人患有痴呆，而这一数字预计将会在2050年上涨到1.31亿。该报告同时也指出，在阿尔茨海默病患者中，仅有40%-50%得到诊断，这主要与缺少廉价、高效、无创伤的诊疗手段相关。

MicroRNAs是一类由2123个核苷酸组成的非编码RNA，不具有翻译成蛋白质的功能，由长度为6070个核苷酸的具有发夹结构的前体microRNAs剪切而来。microRNAs主要功能是在转录后水平调节基因表达，主要通过与其靶基因mRNA的3’-UTR端互补结合降解m RNA或是抑制mRNA的翻译从而阻遏基因的表达[2]。作为一种小分子非编码RNA，由于其片段短、分子量小，能够正常通过体内多种屏障结构如血脑屏障，为脑等较封闭器官的功能研究、新标志物发现提供了新方向[3]。当疾病发生时，病灶器官特异性microRNAs可大量释放入血液，在多种疾病研究中都发现血液microRNAs含量较健康人群有明显差异[4]。迄今为止，以基因组学方法为代表的新的科学技术手段为阿尔茨海默病的机制研究提供了大规模临床数据，利用生物信息学对这些临床检测数据进行进一步分析，探讨阿尔茨海默病发病特征及其机理，可为阿尔茨海默病的早期诊断、治疗及实验研究提供理论依据[5]。在本研究中，我们下载基因表达公共数据库（GEODataSets）中一组利用高通量测序技术得到的阿尔茨海默病患者及其对照组microRNA表达谱。然后进行了显著表达差异的microRNAs筛选，探讨可能成为诊断标志物的microRNA及其在阿尔茨海默病中的调控网络。

1 材料与方法

1.1 阿尔茨海默病相关血液microRNA数据的获取与差异表达筛选

我们在基因表达公共数据库输入关键词“alzheimer disease[AllFields])ANDmicrorna[AllFields])AND("blood"[Subheadi ng]”，检索得到表达谱 GSE46579。该表达谱包含48个阿尔茨海默病患者的样本，由23名男性和25名女性，平均年龄（70.3±7.9）岁，简易精神状态检查表（MMSE）评分18.7±3.5，22例对照组组样本，由11名男性和11名女性，平均年龄（67.1±7.5）岁，MMSE评分29.3±1.2。利用R语言bioconduct or包进行具有显著性差异表达的microRNA 筛选（差异倍数≥1.5，P<0.05）[6]。

1.2 差异microRNA靶标基因的预测

利用targetscan在线预测工具对所得到的差异microRNA进行靶标基因的预测[7]，以Cumulative weighted context++score≤-0.5为筛选标准获得靶标基因[8]。

1.3 差异microRNA靶标基因GO分析以及KEGG通路分析

将1.2中所得靶标基因上传至DAVID在线工具，获得所有基因的分子功能、细胞组分、生物学过程及信号转导通路分析结果。

1.4 差异microRNA调控网络的构建及关键节点的筛选

在1.2靶标基因预测的基础上，将数据输入cytoscape软件构建 icroRNA与基因之间的关系拓扑图，之后将靶标基因上传至string获得蛋白质蛋白质相互作用关系数据并将其输入至cytoscape中[9]，最后将二者合并。筛选联通度≥35的节点作为关键节点[10]。

2 结果

2.1 原始数据平衡结果

首先我们对下载的数据进行了平衡，原始数据对比平衡后的数据见（图1），平衡后的数据中位数大致相同，提示我们平衡后的数据可用于差异表达分析。

图1 原始数据平衡结果Fig.1 Balance of raw data

阿尔茨海默病患者血液中的microRNA表达与正常对照组存在较大差异，按照差异倍数≥1.5，P≤0.05的标准（图 2）。

图2 AD患者差异microRNA筛选标准Fig.2 The standard of different expression miRNA in AD patients

图3中红色代表上调，绿色代表下调，在阿尔茨海默病患者血液中筛选出表达差异有统计学意义的microRNA 共 9个 （表 1） 其中 miR-144、miR-148a、miR-101-1、miR-101-2、miR-17、miR-660、miR-144上调，miR-112、mir-1285下调。分层聚类分析结果提示差异谱结果可靠（图3）。

表1 阿尔茨海默病病人血液差异Tab.1 MicroRANs differential expression micoroRNAs of blood in AD pafients

图3 差异microRNA热图分析Fig.3 Heat-map displaying differential expression microRNAs

2.2 差异microRNA靶标基因的预测及其靶标基因的GO分析和KEGG通路分析结果

通过targetscan预测得到靶标基因共220条，GO分析结果显示：在分子功能上有8个基因富集在小GTP酶介导的信号转导（P<0.01），其余富集的分子功能及详细信息（图4）。KEGG通路分析结果显示:8个基因富集在了FOXO转录因子信号通路中（P<0.01），其余富集的信号通路及其具体信息（图5）。

图4 差异表达microRNA靶标基因分子功能富集统计Fig.4 Molecular function enrichment statistics of differentially expressed microRNA target genes

图5 差异microRNA靶标基因信号通路富集统计Fig.5 Enrichment and statistics of differential microRNA target gene signaling pathways

2.3 差异microRNA调控网络的构建

通过合并microRNA与基因以及蛋白与蛋白相互作用网络（图6），我们构建了上述差异基因在阿尔茨海默病中的调控网络。通过调节联通度来筛选关键的 microRNA，我们将筛选的连通度（degree）提高 至 35 时 ， 其 中 microRNA-148（degree=117）、microRNA-17 （degree=42）、microRNA-660（degree=35）图3中标黄色部分引起了我们的注意，当删除这3个节点后，调控网络涣散。提示我们这3个microRNA可能在该调控网络中起到了关键作用。

图6 差异microRNA调控网络构建Fig.6 Construction of the differential microRNA regulation network

3 讨论[l8]

阿尔茨海默病作为一种慢性退行性疾病，尚缺乏有效诊疗手段，对其早发现早治疗成为了亟待解决的难题。目前临床对阿尔茨海默病的诊断主要依据患者临床症状或表现、神经心理学量表及影像学技术[11]。而用于辅助诊断的分子标志物也大多集中在蛋白质领域，例如脑脊液中的aβ42蛋白和血液Tau蛋白等指标[11，12]，但由于血脑屏障对大分子物质具有高度选择性，蛋白质能否跨过血脑屏障进入血液循环存疑，而且目前脑脊液采集困难，因而限制了其在诊断阿尔茨海默中的作用。而microRNA因其分子片段短小，可调控多种基因表达的特点越来越多的受到人们的重视。

在本研究中，我们利用生物信息学技术筛选出AD病人样本中9种可能作为诊断阿尔茨海默症分子标志物的microRNA，并对其靶基因进行了聚类分析，发现这些靶基因与小G蛋白介导的信号转导、启动子转录调控、心脏小梁形态、活性氧依赖性反应、蛋白复合物的组装、细胞铁离子稳态以及血管生成等功能相关。进而预测了该类microRNA在人体中的调控网络和可能的机制。例如FoxO已经被证实可以促进Aβ蛋白造成的斑块沉积[13-14]，而在本研究中miR-148a可能通过调控sos1、sos2等基因的表达从而调控FOXO信号通路以及ras信号通路参与调节了阿尔茨海默病病理变化。其余包括Ras信号途径、过氧物酶体转导通路、促性腺激素释放激素信号转导通路、雌激素信号转导通路、非小细胞肺癌、T细胞受体信号通路等多种信号通路可能也参与了对阿尔茨海默病的调节，与血液中差异microRNA共同组成了复杂的调控网络，这需要进一步的实验去验证。

为了进一步探讨哪些microRNA在调控网络中发挥了关键作用，我们通过调节cytoscape中的节点连通度筛选到三条发挥核心作用的microRNA，即microRNA-148、microRNA-17、microRNA-660，这 将 对以后的验证及研究工作产生借鉴意义值得进一步深入研究。microRNA-148和microRNA-660的研究主要是集中在癌症领域，其中microRNA-148可能作为判断癌症肿瘤预后及进展的生物学标志物[15]，表明microRNA-148作为分子标志物的可行性，但尚无研究表明二者在神经系统中的作用。已有研究显示，microRNA-17可以通过靶向调控mTOR信号通路促进轴突生长[16]。MicroRNA-148以及micro RNA-17均在炎症的发生发展中具有非常重要的作用[17，18]，这提示阿尔茨海默病的发生可能与炎症反应有着密切的联系。由于筛选方法的不同，本研究通过生物信息学筛选到的核心microRNA与该数据之前的筛选结果不同。但是我们应用的bioconductor包是目前国际上公认的筛选差异表达的常用工具，且我们对数据进行了严格的质量控制包括：平衡数据以及补缺等[19]。

总而言之，我们通过生物信息学筛选首次提出了microRNA-148等9种microRNA可能作为血液中阿尔茨海默症的分子标志物[l9]，同时也提出了microRNA-148、microRNA-17、microRNA-660 这 3 种microRNA可能作为核心microRNA参与了阿尔茨海默症的发生发展，可作为AD诊断的候选标志物。

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