壳聚糖和pH对CHO细胞收获液澄清效率的影响

翁源灿， 杨 彬， 程习文， 鄢成伟， 孙文正

（广东东阳光药业有限公司，广东 东莞 523867）

壳聚糖和pH对CHO细胞收获液澄清效率的影响

翁源灿， 杨 彬*， 程习文， 鄢成伟， 孙文正

（广东东阳光药业有限公司，广东 东莞 523867）

作者研究了壳聚糖和pH对中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary，CHO）培养液料液澄清过程的影响。初步探索了在CHO细胞收获液（pH 7.0）中添加0～0.10 g/dL壳聚糖对0.22 μm膜过滤通量的影响。结果显示，添加0.06 g/dL壳聚糖时膜过滤通量最大，达到8 266.22 L/（m2·h）。探索了pH值（5.0～7.0）对收获液澄清效率的影响，研究发现，不添加壳聚糖的情况下降低培养液pH值对膜过滤通量没有十分显著的提高。为更多地去除宿主细胞蛋白 （Host Cell Protein，HCP）和残留DNA，作者研究了pH值与壳聚糖对膜过滤通量及残留杂质的交互影响。结果表明，pH为5.0壳聚糖质量浓度为0.06 g/dL时滤出液中残留DNA几乎完全去除，HCP含量降低50%以上，而抗体的回收率不受影响。

壳聚糖；pH；CHO；絮凝；料液澄清

中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是外源真核基因的最佳表达系统之一，也是生物制药中最常用的哺乳动物细胞[1-3]，外源蛋白质容易在CHO细胞中合成并分泌到培养基中[4]。在发酵法生产中，发酵液中存在大量细胞、细胞代谢物、剩余培养基以及表达产物组分以外的其他复杂组分。所以在提取精制之前必须进行预处理和过滤以除去这些干扰物质[5-6]。目前比较常用的预处理方法是离心过滤，然而发酵液中有大量的细胞碎片，HCP、DNA密度与水相近，离心并不能去除，所以需要往发酵液中加入絮凝剂[7]，通过吸附架桥作用将小颗粒群或已经凝结的小絮团结合成大絮团，增加颗粒密实度，以利于离心去除，从而改善发酵液过滤性能[8]。

壳聚糖作为一种天然的阳离子吸附剂，本身无毒、无味，不会造成二次污染，是絮凝和回收蛋白质的理想絮凝剂[9]。脱乙酰基时间越长，壳聚糖脱乙酰度越高，相对分子质量越低。一般而言，壳聚糖相对分子质量越大，黏度也越大，絮凝效率也越高[8]。目前关于哺乳动物细胞发酵液通过添加絮凝剂进行料液澄清的研究比较少，生产用途的更少[10]。作者以壳聚糖为絮凝剂，调节发酵液pH值，研究其对絮凝发酵液的影响，寻找一种高效的料液澄清的方法来简化下游处理步骤，以提高效率，降低成本。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

表达单抗的CHO细胞培养收获液：活细胞密度1.90×107/mL，细胞活力90%左右，作者所在实验室培养；脱乙酰度≥90.0的壳聚糖溶液：浙江金壳药业；AR级盐酸：成都科龙化工；WZT-2000型光电浊度计：上海劲佳仪器；L720R-3型高速冷冻离心机：湘离离心机；0.22 μm孔径针头滤器：Millipore；色谱柱：applied biosystems；CHO细胞宿主蛋白抗原标准品、抗CHO细胞宿主蛋白一抗、山羊抗CHO宿 主 蛋 白 HRP 酶 标 二 抗 ：CYGNUS THCHNOLOGIES；微量核酸提取试剂盒：天根。

1.2 实验方法

1.2.1 壳聚糖单因素试验 将细胞收获液分别添加不同质量浓度壳聚糖，控制相同pH，130 r/min搅拌30 min，4 000 g离心20 min、0.22 μm孔径膜过滤、Protein A处理。

1.2.2 pH值单因素试验 将细胞收获液调节不同pH值，130 r/min搅拌30 min，4 000 g离心20 min、0.22 μm孔径膜过滤、Protein A处理。

1.2.3 pH（5.0、6.0、7.0）与壳聚糖质量浓度（0.02、0.04、0.06 g/dL）两因素三水平全因子试验 130 r/min搅拌30 min，4 000 g离心20 min、0.22 μm孔径膜过滤、Protein A处理。

1.2.4 分析方法 发酵液浊度的测定：WZT-2000型光电浊度计检测；抗体浓度的测定：HPLC法检测；HCP的测定：ELISA法检测；残留DNA的测定：实时荧光定量PCR法检测。

2 结果与讨论

2.1 壳聚糖单因素实验结果

壳聚糖单因素实验结果见图1。在收获液pH 7.0，壳聚糖终质量浓度0～0.1 g/dL范围内，收获液经离心后的浊度与壳聚糖质量浓度明显呈反比，最高降低60%。离心后的收获液用0.22 μm孔径滤器过滤，通量显著提高，质量浓度为0.06 g/dL时通量最高，达497.81 L/（m2·h），说明壳聚糖添加量的提高可以使收获液中更多的微粒被聚集为大颗粒，离心效果更明显。而当质量浓度为0.1 g/dL时，收获液粘度增大，过滤通量反而下降，抗体回收率无明显影响，均在90%左右。

2.2 pH值单因素实验结果

pH单因素实验结果见图2。pH值在5.0～7.0间变化，对离心后收获液浊度及过滤通量影响不明显，其中在pH 5.0的浊度稍微降低，过滤通量提高了，抗体回收率无明显差异，说明单纯的改变pH值对收获液的澄清效率并不起明显的作用。

图1 壳聚糖质量浓度影响效果实验Fig.1 Effect of chitosan concentration experiment

图2 pH值影响效果实验Fig.2 Effect of pH experiment

2.3 pH与壳聚糖全因子试验结果

pH （5.0、6.0、7.0）与壳聚糖质量浓度（0.02、0.04、0.06 g/dL）全因子试验结果用Minitab统计软件分析，结果见图3。主效应图3（a），收获液离心后浊度随着pH降低和壳聚糖质量浓度的增加均有降低的趋势，图3（b）中0.22 μm孔径膜过滤通量随着pH降低和壳聚糖质量浓度的增加亦有显著的提高，图3（c）中显示pH的降低会降低膜过滤后产品收率，而不同壳聚糖质量浓度对抗体收率没有明显的影响，图3（d）中pH的降低和壳聚糖质量浓度的增加明显降低收获液中HCP的质量浓度，图3（e）中降低pH的收获液，其残留DNA质量浓度更高，而随着壳聚糖质量浓度的增加，DNA质量浓度明显降低。

图3 主效应图Fig.3 Main effect diagram

在交互作用图4（a）中，当pH为5.0、壳聚糖质量浓度为0.06 g/dL时，收获液离心后浊度最低；图4（b）中，当pH为5.0、壳聚糖质量浓度为0.06 g/dL时，0.22 μm孔径膜过滤通量最高；图4（c）中可以看出，在壳聚糖质量浓度为0.02 g/dL和0.04 g/dL时，随着pH降低，产品回收率有下降的趋势；图4（d）显示，壳聚糖质量浓度为0.06 g/dL时，收获液HCP质量浓度降低更明显，当pH降低到5.0时，HCP质量浓度更低，在图4（e）中，当pH降低时，收获液残留DNA质量浓度更高，而随着壳聚糖质量浓度的增加，DNA质量浓度逐渐降低。

图4 交互作用图Fig.4 Interaction diagram

试验结果表明，在不同的pH条件下，壳聚糖对收获液澄清效率有着相同的趋势；在不同壳聚糖质量浓度下，pH对收获液澄清效率也有着相同的趋势。在交互作用图中可以看出，不同条件组合的产生影响的趋势明显不同，说明在收获液澄清方面，pH与壳聚糖之间有互相促进作用。当pH降低时，壳聚糖被质子化，絮凝性能提高，更多的聚集了HCP，但同时低pH条件下，细胞死亡率更高，释放出更多的DNA，导致收获液中残留DNA质量浓度相对较高。

3 结语

壳聚糖具有良好的生物相容性和可降解性，其结构与细菌细胞壁上的肽聚糖类似，可被体内的溶菌酶及水解酶等降解成葡萄糖胺或壳寡糖[12]，对核酸、蛋白质等物质都有吸附能力，其带正电[13]，是一种很好的天然吸附剂。参照张明政[12]研究的方法，模拟CHO收获液收获时的pH值，初步摸索壳聚糖质量浓度和pH值对收获液澄清效率的单一影响，发现单独改变壳聚糖质量浓度或pH值，其效果并非最优。组合后发现，不同组合之间效果差异明显，也优于单因素效果，综合分析后确定该细胞收获液的最佳絮凝条件：pH 5.0、壳聚糖质量浓度0.06 g/dL。浊度可降低70 NTU以上，膜过滤通量显著提高，抗体回收率无明显影响，HCP质量浓度降低一倍，DNA几乎完全去除，结果趋势与文献提到的基本吻合。

通过壳聚糖对CHO细胞发酵液的絮凝处理，可以去除大量有色物质，添加壳聚糖后搅拌过程中，发酵液逐渐产生乳白色絮状物，离心后澄清液比对照颜色更浅，随着壳聚糖质量浓度的增加，颜色差异更明显。然而当壳聚糖质量浓度达到发酵液的0.1 g/dL时，其粘度增大，过滤性能并非最优。pH较低时，收获液中HCP容易沉淀析出，易于分离。DNA在正常pH条件下带较强的负电荷，实验结果表明，pH与壳聚糖能对收获液澄清效率产生交互影响，在稀酸溶液中壳聚糖因质子化而带更多的正电荷，从而提高絮凝性能[15]，因此澄清效果更好。壳聚糖具有抗菌性能[16]、生物粘附性[17]等，其抗菌性可能对该发酵液防止微生物污染有一定的作用。生物粘附性可能会增加药物在体内的滞留时间，从而提高药物的利用效率[14]。

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Effect of Chitosan and pH on Clarification Process Efficiency of Harvested CHO Cell Culture Fluid

WENG Yuancan， YANG Bin*， CHENG Xiwen， YAN Chengwei， SUN Wenzheng
（Sunshine Lake Pharma Co.，Ltd，guangdong dongguan 523867，China）

Chitosan is a natural，non-toxic and biodegradable flocculant.This study focused on determining and optimizing the clarification process efficiency in the presence of various concentrations（0～0.10 g/dL）of chitosan at different pH 5.0～7.0 for the harvested Chinese hamster ovary （CHO）cell culture fluid （HCCF）（pH 7.0）.Following HCCF was treated with 0.06 g/dL chitosan，the filtration flux was achieved up to 8 266.22 L/（m2·h）using 0.22 μm filter.In addition，the result showed that similar filtration flux for HCCF at different pH without chitosan addition whereas increasing filtration flux was achieved when HCCF pre-treated with chitosan at decreasing pH.To further improve this clarification process，the combined effect of various concentrations of chitosan at different pH on the filtration flux and the removal of process impurities including host cell proteins （HCP）and residual DNA in HCCF was evaluated.The result of a full factorial experiment including two factors and three levels（chitosan at 0.02，0.04，0.06%and pH at 5，6，7）showed that 90%antibody product yield with nearly complete removal of residual DNA and 50%more reduction of HCP were obtained when HCCF pre-treated with the optimal 0.06 g/dL chitosan at pH 5.0.

chitosan，pH，CHO，flocculation，centrifugal filtration

TS 202.3

A

1673—1689（2017）03—0322—05

2015-03-18

广东省引进创新科研团队计划项目（201101Y0104990178）。

＊通信作者：杨 彬（1981—），男，湖北鄂州人，理学硕士，主要从事生物制药方面的研究。E-mail：yangbin@hecpharm.com

翁源灿，杨彬，程习文，等.壳聚糖和pH对CHO细胞收获液澄清效率的影响[J].食品与生物技术学报，2017，36（03）：322-326.