5岁以下喘息患儿哮喘预测指数与外周血单核细胞TLR4表达的相关性研究

姜 朕，李卫华，朱 峰，魏海燕，齐共健

(江苏省徐州市儿童医院重症医学科 221006)

·论 著·

5岁以下喘息患儿哮喘预测指数与外周血单核细胞TLR4表达的相关性研究

姜 朕，李卫华△，朱 峰，魏海燕，齐共健

(江苏省徐州市儿童医院重症医学科 221006)

目的 探讨5岁以下喘息患儿外周血单核细胞(PBMCs)表面Toll 样受体4(TLR4)及血清白细胞介素6(IL-6)的表达。方法 选取该院门诊或住院患儿共224例，其中哮喘预测指数(API)阳性组116例，阴性组108例。两组患儿均在喘息症状缓解1个月后分别抽取外周血，流式细胞仪检测PBMCs TLR4阳性率，酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清IL-6水平。结果 API阳性组患儿CD14+单核细胞表面TLR4阳性率明显高于API阴性组[(34.9±10.0)%vs.(30.2±8.8)%]；API阳性组患儿血清IL-6水平明显高于API阴性组[(46.4±15.1)ng/Lvs.(40.5±13.6)ng/L]；且两组TLR4阳性率和IL-6水平均呈线性相关(P<0.05)。结论 TLR4的激活诱导IL-6等细胞因子表达可能和哮喘的发生、发展有关，TLR4可能可以作为喘息发展为哮喘的预测指标。

Toll样受体4；白细胞介素6；哮喘

喘息是婴幼儿的一种常见症状，过敏性哮喘是其中的一种重要表型。从喘息患儿中把可能发展为持续性哮喘的患儿识别出来进行早期干预是必要的。然而，由于缺乏特异性的检测指标，很难做到早期识别。哮喘预测指数(asthma predictive index,API)是一种较好的预测婴幼儿哮喘的指标[1-2]，目前认为API阳性的婴幼儿需按哮喘规范化治疗。Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)是参与非特异性免疫(天然免疫)的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。研究表明，哮喘与TLR4关系密切，但其与API的关系尚不明确[3]。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择 2014 年 6月至 2015 年 5月在本院门诊就诊和住院治疗的 5 岁以下喘息患儿 224例。根据2008年儿童支气管哮喘诊断与防治指南中API 标准[4]分为API阳性组(116例)与API阴性组(108例)。两组患儿在月龄、性别、病程等一般情况方面差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

1.2 方法

1.2.1 CD14+单核细胞表面TLR4表达检测 两组喘息患儿均在喘息症状缓解1个月后采集外周静脉血10 mL。测定外周血CD14+单核细胞TLR4的表达。根据文献报道采用流式细胞仪检测CD14+单核细胞表面TLR4的表达[5]。FACS VantageSE流式细胞仪购自美国BD公司；FITC anti-human CD14+抗体、PE anti-human CD284(TLR4)抗体购自美国Biolegend公司。

表1 两组患儿一般情况

1.2.2 血清白细胞介素6(IL-6)水平检测 酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测血清IL-6水平，人IL-6 ELISA试剂盒购自加拿大HCB公司。

2 结 果

2.1 两组患儿CD14+单核细胞表面TLR4及血清IL-6的表达 API阳性组患儿CD14+单核细胞表面TLR4阳性率明显高于API阴性组，差异有统计学意义(P<0.05)。API阳性组患儿血清IL-6水平明显高于API阴性组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组患儿TLR4及IL-6的表达

2.2 PBMCs TLR4表达水平与血清IL-6水平线性相关分析 经线性相关分析表明，在API阴性组及API阳性组患儿TLR4阳性率水平与血清IL-6表达水平均呈正相关(图1)，API阳性组相关系数r=0.861，P<0.05；API阴性组相关系数r=0.901，P<0.05。

图1 两组患儿PBMCs表面TLR4表达 和血清IL-6水平散点图

3 讨 论

目前，婴幼儿喘息主要有3种表型[4]：(1)早期一过性喘息，表现为在3岁前有1次以上的喘息，到3岁后就无喘息症状，其喘息的机制可能是由环境因素导致肺发育延迟所致，个体过敏证据较少。(2)早期起病的持续性喘息(3岁前起病)，主要表现为与急性呼吸道病毒感染相关的反复喘息。(3)迟发性喘息/哮喘，即真正意义上的支气管哮喘，患儿有典型的特应性背景，哮喘症状常迁延至成人期，气道有典型的哮喘病理特征。从喘息的婴幼儿中把可能发展为哮喘的患儿识别出来存在一定的困难，这也是目前的一大研究热点。Castro-Rodíguez等[6]于2000年提出哮喘API的概念，其能有效地预测3岁内喘息儿意发展为持续性哮喘的危险性，它的应用价值日益受到重视。

在哮喘的发病机制方面，TLR4在哮喘中的生物学作用越来越受到人们的重视。TLR4是Toll样受体家族成员之一。其作为一种模式识别受体，在抗感染与免疫信号的转导过程中起重要作用。当脂多糖等配体与TLR4结合后，通过髓样分化因子88(MyD88)介导下游的信号转导，激活AP-1、NF-κB 和IRF3等转录因子，诱导促炎性细胞因子(如IL-6 和TNF-α等)和趋化性细胞因子(如IL-8)等多种细胞因子的表达，启动炎症和适应性免疫应答[7]。研究表明，TLR4信号通路的激活可以引起局部慢性炎症反应、氧化应激等增加，从而导致哮喘、代谢综合征、糖尿病等疾病的发生[8]。大量的研究表明，TLR4基因多态性和哮喘的发生及严重程度相关。TLR4 rs1927907基因多态性和CD4+T细胞表面TLR4的表达量及哮喘的严重程度相关[9]。2015年11月4日在美国公共卫生协会会议中，Bravo 等[10]报道了1项研究前瞻性研究，该研究选取了1 823名志愿者，研究了基因多态性和居住环境的关系，研究表明，高应答者(携带CD14、TNF-α和野生型 TLR4、TIRAP基因)较低应答者(携带TLR4、TIRAP 和野生型CD14、TNF-α基因)更容易的哮喘；白人较黑人或非洲裔美国人更容易的哮喘；居住地离马路较近(<250 m)的人群中，高应答者较低应答者更易得哮喘。Lee等[3]观察了7 389名中学生发现抗生素暴露及毛细支气管炎病史是哮喘的危险因素，TLR4 rs1927911多态性可以减轻这种遗传易感性。Kim等[11]研究发现，房尘螨可以通过TLR4/PKCδ/ERK/NF-κB信号通路抑制中性粒细胞凋亡，促进IL-6、IL-8、TNF-α、G-CSF、GM-CSF等炎症因子的表达，从而介导过敏性鼻炎、哮喘等的发生。Liu等[12]研究表明，房尘螨可以同时激活TLR2和TLR4受体，调整肺泡巨噬细胞激活模式，导致Th2为主导的优势免疫，从而介导了哮喘的发生。Th1/Th2亚群数目和功能失衡是哮喘重要的免疫学特征。近期研究发现，哮喘不仅与Th1/Th2细胞功能失调相关，还与Th17细胞的激活有着重要关系[13]。活化的Th17细胞可以进一步激活平滑肌细胞、支气管纤维母细胞及上皮细胞，促使它们分泌IL-6等多种细胞因子，导致气道局部慢性炎症反应[14]。而诱导Th17细胞分化的关键细胞因子就是IL-6[15]。研究表明，IL-6水平和哮喘的严重程度及肺功能密切相关[16]。IL-6与TLR4可以相互影响，在哮喘的发病及进展中起重要作用[17]。

目前，TLR4和喘息的关系方面的研究较少，本研究观察了API阳性组与阴性组PBMCs TLR4阳性率及血清IL-6水平。研究表明，API阳性组PBMCs TLR4阳性率及血清IL-6明显高于API阴性组，且两组TLR4阳性率和IL-6水平呈正相关，提示部分喘息患儿通过TLR4的激活产生IL-6等炎症因子，诱发哮喘的发生、发展。TLR4可能成为预防喘息患者发展为哮喘的重要干预靶点。另外，喘息患者中可以通过检测患者PBMCs TLR4阳性率及相关炎症因子水平预测哮喘的发生，从而早期干预，但仍需要大规模临床试验的证实。

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Correlation between Toll-like receptor 4 in peripheral blood monocytes and asthm predictive index in wheezing children under 5 years of age

JiangZhen,LiWeihua△,ZhuFeng,WeiHaiyan,QiGongjian

(DepartmentofIntensiveCareUnit,XuZhouChildren′sHospital,XuZhou,Jiangsu221006,China)

Objective To study the expression of Toll-like receptor 4(TLR4) in peripheral blood mononuclear cell (PBMCs) and serum interleukin-6(IL-6) in wheezing children under 5 years of age.Methods A total of 224 wheezing children under 5 years of age were divided into API(asthma predictive index)-positive (n=116) and API-negative groups (n=108).Serum level of IL-6 and TLR4 expression on CD14+monocytes were measured after wheezing was stable for one month.TLR4 expression on CD14+monoeytes was quantified via flow-cytometry.Serum level of IL-6 was detected by ELISA.Results Serum level of IL-6 and TLR4 expression on CD14+monocytes of API-positive group were higher than API-negative group [LR4(%):34.9±10.0vs. 30.2±8.8;IL-6(ng/L):46.4±15.1vs. 40.5±13.6].There was a significant positive correlation between the expression of TLR4 and the content of serum IL-6 in two groups of wheezing children(P<0.05).Conclusion TLR4 may play a role in the pathogenesis of asthma through promoting the expression of IL-6.TLR4 may be a index to predicting asthma in wheezing children.

Toll-like receptor 4;interleukin-6;asthma

姜朕(1981-)，副主任医师，本科，主要从事儿童危重症研究工作。△

，E-mail:13685177688@163.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.08.002

R725.6

A

1671-8348(2017)08-1012-03

2016-09-28

2016-12-16)