X染色体Amelogenin基因座片段扩增峰图异常1例及荧光定量分析

时永胜 胡锡阶 周单华 万卫红 余 舰 章 涛 刘祖林余丽梅＊

1．遵义医学院附属医院，贵州省细胞工程重点实验室（563003）；2．遵义医学院法医学鉴定中心

AMEL基因座（amelogeni，AMEL牙釉基因座）是法医学在进行亲子鉴定和个体识别中性别确认时常用的基因座，是X、Y染色体上的同源染色体基因，位于X染色体的Xp22．1－Xp22．3和Y染色体的Yp11．2，编码牙釉质蛋白［1］。不同试剂盒扩增，这一基因的产物长度有所不同［2］。以往采用IdentifilerTM、PowerPlex 16等不同 PCR 扩增试剂盒进行亲权鉴定时，对AMELX、AMELY等位基因座丢失进行了 报 道［3－11］。美国 Applied Bioystems公司生产的人类荧光标记短串联序列（STR）复合扩增检测试剂盒（华夏白金试剂盒）是针对中国人的基因频率变化在IdentifilerTM试剂盒基础上除性别染色体STR 外，增 加 Penta E、D2S441、D22S1045、D6S1043、D10S1248、D1S1656、D12S391、Penta D八个基因座，以提高亲权鉴定的准确性，两种试剂盒模板DNA含量的线性范围均为0．5～1．25ng／25 μl。但实际工作中，发现个别微量样本检测时，两种试剂盒扩增后的测序检测结果存在一定差异，由此可想，在遇到AMEL基因片段扩增缺失时，也需审慎分析，为此，本研究在二联体亲权鉴定中，就华夏白金试剂盒与IdentifilerTM试剂盒检测父亲AMELX等位基因座扩增丢失进行了对比分析。

1 对象与方法

受检者为争议父亲（37岁，WJ2016－0552－3）和女儿（7岁，WJ2016－0552－2）。检材为二者的EDTA－K2抗凝静脉血，第一次检测时采用FTA卡制血斑，华夏白金试剂盒（AB公司，美国）进行复合PCR扩增，用3500DX遗传分析仪（AB公司，美国）进行毛细管电泳，并用GeneMapper软件进行图谱分析。确认实验用Generation Capture Column试剂盒固相提取DNA（Qiagen公司，德国），Identifiler试剂盒（ABI公司，美国）进行PCR复合扩增，3100 Avant遗传分析仪进行毛细管电泳分离，并通过Gene Scan Software V3．7 软 件、Genotyper SoftwareV3．7软件进行数据采集与STR基因分型。

2 结果

2．1 华夏白金和Identifiler TM试剂盒等位基因分型

华夏白金试剂盒等位基因分型结果包括24个STR基因座（表1），累积非父排除率（CPE）＞0．999 9，计算累积父权指数（CPI）为 40 242 160 823．630 1，累积相对父权机会（RCP）为0．999 999 999 975 15，支持疑父为该女儿的生物学父亲。IdentifilerTM试剂盒结果除无前所述8个基因座外，其余基因座分型结果同华夏白金试剂盒等位基因分型结果，也同样支持疑父和女儿的生物学父女关系。

2．2 AMEL基因座分型图谱

在华夏白金试剂盒扩增检测图谱中，与分型标准无比对，WJ2016－0552－3样本 Y染色体上的AMEL基因座峰图明显可见（图1），而未见X染色上的AMEL基因座峰图。采用IdentifilerTM试剂盒扩增图谱（图2）也与图1相似，即未见争议父X染色体的AMEL基因座峰图，仅存在Y染色体AMEL基因座峰图。而通常二联体亲子鉴定中，两个试剂盒扩增的图谱分别如图3（华夏白金试剂盒扩增）、图4（IdentifilerTM试剂盒扩增）所示，在X、Y两条染色体上均可见明显的AMEL基因座峰图。

表1 STR基因座中不同染色体上的短串联序列重复次数

图1 华夏白金试剂盒扩增父基因后的基因分型图谱

图2 Identifiler试剂盒扩增父基因后的基因分型图谱

图3 华夏白金试剂盒扩增后正常对照的X、Y染色体AMEL基因座峰

图4 Identifiler TM试剂盒扩增后正常对照的X、Y染色体AMEL基因座峰

2．3 荧光定量结果及比值分析

对于IdentifilerTM试剂盒扩增样本的分型图谱，最大扩增产物＜350bp，扩增容易，峰高均一。对本案例进行峰高、峰面积分析结果显示，正常男性X／Y染色体AMEL等位基因座峰高峰面积比值约为1，疑父与正常男性的Y染色体AMEL等位基因座峰高峰面积比值也约为1。本检案中父亲X染色体没有AMEL等位基因座峰，女儿的X染色体AMEL等位基因座峰高、峰面积均约为正常对照者的一半（表2、表3）。

表2 Identifiler TM试剂盒AMEL等位基因座荧光定量分析结果

表3 女儿与正常女性、疑父与正常男性性染色体荧光定量比值分析（%）

3 讨论

检案中华夏白金试剂盒扩增后，AMEL基因座分型图谱发现，虽然疑父Y染色体上的AMEL基因明显可见，但出现了X染色体上AMEL基因丢失，与以往研究报道父亲或儿子AMEL X等位基因丢失相似，所用PCR扩增的Identifiler、Goldeneyes 20A 、GlobalFilerTM和 PowerPlex 16试剂盒不同，产物长度存在差异［2，11－12］，中国人群 X 染色体和 Y染色体中AMEL等位基因总突变率为0．045%，男性群体中的突变率为0．085%［12］。进而采用Identifiler试剂盒扩增，取得了与华夏白金试剂盒扩增一致的AMEL基因座分型图谱，试验结果也证明父亲X染色体存在AMEL基因的扩增丢失。而女儿的AMEL基因座峰高和峰面积为正常对照的一半（正常情况下与正常对照的峰高和峰面积应大约相等），女儿的其中一条X染色体遗传于父亲，父亲无峰图，说明女儿出现这种峰图的最大可能是由于在扩增时由于引物区突变或真正缺失AMEL基因导致峰图异常。遗憾的是后期因血样不足，提取DNA剩余血样送华大基因测序无法得出结果，也即无法证实AMEL基因座扩增缺失是基因缺失，还是引物区发生变异导致。

AMEL X等位基因的缺失或突变会可能为X－连锁遗传或新发突变，可引起牙釉质发育不全［13］。理论上疑父的AMEL基因缺失会遗传给女儿，可能在女儿表现出牙釉质发育不全的临床表型，女儿X染色体上AMEL峰应为单源峰，即只来源于母亲。若定量分析，如克氏综合征（XXY）的峰图［13］，就有两个相同的X染色体AMEL等位基因，其峰高、峰面积约为单X染色体AMEL等位基因峰图的两倍。正常女性AMEL基因座纯合子期望峰高、峰面积应约为杂合子的两倍或接近两倍［2］。

华夏白金试剂盒，因采用直扩方式，未定量DNA浓度，受血卡上血样厚薄差异及打血卡大小等影响，难以准确进行AMEL缺失者与正常对照者AMEL峰高、峰面积的比较分析。这也提示，在采用华夏白金试剂盒扩增时或缺乏分型标准比对情况下，若出现了Y染色体AMEL基因缺失的个体识别中，或采用常用华夏白金试剂对非整倍体染色体疾病进行DNA遗传分析检测时，应改用先抽提基因组DNA，定量检测DNA含量，确保DNA浓度高于试剂盒的最低检测线，或采用IdentifilerTM等其他试剂盒进行验证，避免性别错判，或因峰高、峰面积错误分析，出现对克氏综合征或21－三体综合征等病症的遗漏。

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