晚期糖基化终末产物诱导皮肤成纤维细胞中lncRNA表达谱的变化

胡梦蝶 周立艳 王晓艺 王 维 任 萌 严 励

晚期糖基化终末产物诱导皮肤成纤维细胞中lncRNA表达谱的变化

胡梦蝶 周立艳 王晓艺 王 维 任 萌 严 励*

目的探讨长链非编码RNA（lncRNA）在晚期糖基化终末产物（AGEs）诱导的皮肤成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞中表达谱的差异。方法利用lncRNA芯片技术检测AGEs诱导的皮肤成纤维细胞与正常皮肤成纤维细胞中lncRNA表达谱的变化，经过对原始数据进行标准化处理后，筛选出差异表达lncRNA。结果与正常培养的皮肤成纤维细胞相比较，24 h AGEs诱导的皮肤成纤维细胞中差异表达的lncRNA有3421条，其中1079条表达上调，2342条表达下调，差异表达达10倍以上的lncRNA有448条，其中208条表达上调，240条表达下调。结论与正常皮肤成纤维细胞相比较，AGEs诱导的皮肤成纤维细胞的lncRNA的表达谱发生了显著的变化，提示lncRNA可能参与了糖尿病皮肤病变的发生、发展。

长链非编码RNA；晚期糖基化终末产物；皮肤成纤维细胞；糖尿病皮肤病变；糖尿病足

糖尿病皮肤病变是糖尿病的慢性并发症之一，糖尿病患者的皮肤极易损伤，而且损伤后往往迁延不愈，形成慢性难愈性溃疡。糖尿病足溃疡是糖尿病皮肤病变的主要表现，也是导致糖尿病病人截肢的重要原因，给患者和社会带来了沉重的负担［1，2］。作为构成皮肤真皮层的主要细胞，皮肤成纤维细胞在创面愈合、组织重塑等方面发挥了重要的作用［3］。研究表明，葡萄糖和血浆中蛋白质通过非酶糖基化反应，形成晚期糖基化终末产物（advanced glycosylation end products，AGEs），其可通过抑制成纤维细胞的增殖、迁移和分泌能力，增加成纤维细胞的凋亡、自噬［4，5］，从而延缓伤口的愈合［6］。

长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一类转录本长度超过200nt的RNA。lncRNA不具有蛋白编码能力，但可在表观遗传、转录及转录后等多种层面上调控基因的表达［7］。研究表明，lncRNA广泛参与细胞增殖、分化及凋亡等多种生物学过程，与多种疾病的发生发展密切相关［8］。近年来的研究表明，lncRNA参与调控胰岛β细胞的分化和成熟［9］，并且其异常表达与糖尿病心肌病［10］、糖尿病视网膜病变［11］和糖尿病肾病［12］等多种糖尿病并发症相关。目前尚未见到lncRNA在糖尿病皮肤病变中的相关报道。本研究以AGEs模拟糖尿病环境，利用lncRNA芯片比较AGEs作用下的皮肤成纤维细胞lncRNA表达谱的变化，为探讨lncRNA在糖尿病皮肤病变中的作用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

大鼠皮肤成纤维细胞株（CRL⁃1213）购自美国标准生物品收藏中心（American type culture col⁃lection，ATCC）；胎牛血清购于Corning公司；DMEM培养基，Trizol试剂购于Invitrogen公司；AGE⁃BSA购于Merck Millipore公司；Rat LncRNA V2.0 Microar⁃ray为Arraystar公司产品；mRNA⁃ONLYTMEukaryot⁃ic mRNA Isolation Kit购自Epicentre公司；RNeasy Mini Kit购自QiAGEsn公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养皮肤成纤维细胞在含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，置于含5%CO2的37℃恒温箱中。取对数生长期的成纤维细胞以3× 105个/孔接种于六孔板中，贴壁后待细胞融合达60～70%时加入AGE⁃BSA（终浓度为200 μg/mL），继续培养24 h后收集细胞，对照组以200 μg/mL BSA培养24 h，对照组和实验组各设3个平行。

1.2.2 细胞总RNA的提取及检测按照Trizol试剂说明书提取总RNA，使用Nanodrop⁃1000紫外分光光度计测定RNA在230 nm、260 nm和280 nm的吸光度值，评估RNA量和质量，通过标准变性凝胶电泳评估RNA完整性。

1.2.3 RNA标记和芯片杂交根据Agilent One⁃Color Microarray⁃Based Gene Expression Analysis（Agilent Technology）实验方案执行。使用mRNA⁃ONLYTMEukaryotic mRNA Isolation Kit从总RNA中移除rRNA后，得到mRNA；设计随机引物使样品放大并转录成带荧光的cRNA；通过RNeasy Mini Kit纯化标记的cRNAs，并用NanoDrop ND⁃1000检测浓度和活性；利用杂交试剂盒将标记好的探针与芯片进行杂交；杂交后进行芯片洗涤、固定。

1.2.4 数据分析使用Agilent DNA Microarray Scanner对杂交后的芯片进行扫描得到图像，使用Agilent Feature Extraction v11.0.1.1软件对芯片图读值并获得原始数据。使用GeneSpring GX v12.1软件对获得的基因芯片原始数据进行分位数标准化处理，筛选高质量探针（某探针在6个样品中至少有1个被标记为Present或Marginal）进行进一步分析。同一lncRNA或mRNA在两组之间表达差异超过2倍，并且经过t检验P值小于0.05被认定存在差异表达，根据差异表达的mRNA进行GO和KEGG Pathway分析。

1.3 统计学方法

使用SPSS 22.0软件进行统计学分析，两组间比较采用t检验，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 芯片杂交结果

芯片数据筛选结果显示，与对照组相比，24 h AGEs诱导的皮肤成纤维细胞中有3421条lncRNA存在表达差异，其中1079条表达上调，2342条表达下调，差异表达10倍以上的lncRNA有448条，其中208条表达上调，240条表达下调。

2.2 lncRNA子类分析

2.2.1 差异反义lncRNA（antisense lncRNA）与相应mRNA联合分析在差异表达的lncRNA中，有44条lncRNA为antisense lncRNA（20条表达上调，24条表达下调），这些antisense lncRNA可能通过多种机制调控正义（sense）mRNA的表达（表1），从而发挥生物学功能。

2.2.2 差异基因间lncRNA（long intergenic noncod⁃ing RNA，lincRNA）与邻近mRNA联合分析在差异表达的lncRNA中，有422条lncRNA为lincRNA（213条表达上调，209条表达下调），这些lincRNA可能通过调控邻近mRNA（＜300 kb）的表达（表2），从而发挥生物学功能。

2.3 差异mRNA的GO分析和pathway分析

2.3.1 GO分析上调的mRNA中，细胞因子活性（cytokine activity）是富集程度最高的分子功能，细胞通讯（cell communication）是富集程度最高的生物过程，细胞质膜（plasma membrane）是富集程度最高的细胞组分；下调的mRNA中，G蛋白偶联受体活性（G⁃protein coupled receptor activity）是富集程度最高的分子功能，G蛋白偶联受体信号通路（G⁃protein coupled receptor signaling pathway）是富集程度最高的生物过程，细胞质膜（plasma mem⁃brane）是富集程度最高的细胞组分。

2.3.2 KEGG pathway分析在上调的mRNA中，细胞因子-细胞因子受体相互作用（Cytokine⁃cyto⁃kine receptor interaction）为富集程度最高的通路（图1），在下调的mRNA中，嗅觉传导（Olfactory transduction）为富集程度最高的通路（图2）。

表2 差异lincRNA与邻近mRNA联合分析（lncRNA差异倍数＞50倍）

3 讨论

随着我国经济发展和人民生活方式的改变以及寿命的延长，糖尿病患病率急剧增加，随之而来的糖尿病各种慢性并发症的发生率也逐年增加。糖尿病足是糖尿病的主要慢性并发症之一，也是糖尿病致残致死的重要原因。长期高血糖造成的皮肤局部微环境的改变与外周血管病变和外周神经病变等因素共同导致的糖尿病皮肤病变是糖尿病足的发病基础［13］。

临床研究发现，糖尿病患者虽然经治疗后血糖已降至正常或接近正常，仍然容易发生糖尿病的慢性并发症，这是由于患者在确诊糖尿病之前就已经出现糖耐量异常，机体随之形成了代谢性记忆。这种现象被称为血糖的“代谢记忆效应”［14］。高血糖的代谢记忆效应发生机制目前仍不清楚，表观遗传调控可能通过影响代谢性记忆的发生而参与糖尿病及其并发症的发病机制［15］。表观遗传调控包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、非编码RNA调控等等。占非编码RNA绝大部分的lncRNA曾被认为是进化过程中无功能的“垃圾序列”，是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能，然而，随着研究的深入，已发现lncRNA可在多个层面上广泛参与细胞增殖、分化乃至个体发育等多种重要的生理过程，并与多种疾病的发生发展密切相关［8］。

目前关于lncRNA的研究多集中在肿瘤领域，在糖尿病及其并发症的领域还很少。Moran等［9］首次全面的报道了人类胰岛β细胞的lncRNA表达谱，并发现lncRNA的表达具有阶段特异性的特点，这提示了lncRNA可能参与调控β细胞的分化和成熟。进而该研究确定了一条人胰岛β细胞特异表达的lncRNA⁃HI⁃LNC25，其能够正向调节胰岛转录因子GLIS3的mRNA，提示lncRNA可能参与调控胰岛β细胞的功能［9］。此外，lncRNA βlinc1可通过协同调控特异性的胰岛β细胞的转录因子从而影响β细胞功能［16］。

图1 上调的mRNA富集程度最高的10条通路

图2 下调的mRNA富集程度最高的10条通路

在lncRNA与糖尿病并发症方面的研究，目前已发现lncRNA参与糖尿病心肌病、糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病以及糖尿病神经病变等多种糖尿病并发症的发生发展。糖尿病心肌病方面，MALAT1在糖尿病大鼠心肌组织中特异性高表达，下调MALAT1的表达可增加大鼠左心室的收缩功能［10］。糖尿病视网膜病变方面，运用lncRNA芯片筛选糖尿病小鼠视网膜差异表达的lncRNA，发现在早期糖尿病视网膜病变有303条lncRNA差异表达，其中214条表达下调，89条表达上调，GO分析以及KEGG分析显示，这些差异表达的lncRNA主要参与了眼靶向发育、膜的完整性、结构分子活性等过程［17］。此外，有研究发现，MALAT1在内皮细胞中丰富表达，可通过p38/MAPK信号通路影响视网膜内皮细胞的功能和血管的新生［11，18］。糖尿病肾病方面，近年来发现，lncRNA CYP4B1⁃PS1⁃001与PVT1都参与了系膜细胞的增殖与纤维化，介导细胞外基质的积累［12，19］，而lncRNA MIAT则可介导高糖诱导的肾小管上皮损伤［20］。这些lncRNA均参与了糖尿病肾病的发生和发展。

本研究通过体外建立糖尿病皮肤细胞模型，以AGEs作用24 h的皮肤成纤维细胞模拟糖尿病皮肤状态，以正常培养下的成纤维细胞作为对照，分析AGEs诱导皮肤成纤维细胞lncRNA表达谱的变化。已有研究证实，AGEs可抑制皮肤成纤维细胞的增殖、迁移和分泌能力，增加成纤维细胞的凋亡和自噬水平［4-6］，使糖尿病患者皮肤组织发生一定程度的病理生理改变，导致自发性溃疡的发生且延缓愈合。我们的研究结果发现，AGEs能引起成纤维细胞中3421条的lncRNA发生显著变化，其中差异表达10倍以上的lncRNA有448条，提示这些lncRNA可能参与影响皮肤成纤维细胞的各种生物学功能，在糖尿病皮肤病变中发挥了一定的作用。在后续实验中，我们将对lncRNA进行验证，并进行进一步的功能研究，探讨lncRNA是否参与了AGEs诱导成纤维细胞生物学行为改变的过程，并通过生物信息学分析，预测lncRNA可能的靶基因，并进行验证，以期阐明lncRNA在糖尿病皮肤病变中的作用。

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Expression profiles of long noncoding RNA in advanced glycosylation end products treateddermal fibroblast

HU Mengdie，ZHOU Liyan，WANG Xiaoyi，WANG Wei，REN Meng，YAN Li.Department of Endocrinology and Metabolism，Sun Yat⁃sen Memorial Hospital，Sun Yat⁃sen University，Guangzhou，510120，China.Corresponding author：YAN Li，hfxyl@163.net

ObjectiveTo explore the expression profile variation of long noncoding RNA（IncRNA）in advanced glycosylation end products（AGEs）treated dermal fibroblast compared with normal dermal fibroblast.MethodsThe differences of lncRNA expression profile between AGEs treated fibroblast and normal fibroblast were analyzed through lncRNA microarray.LncRNA with differential expression were screened out after pretreatment of raw data.ResultsCompared with normal fibroblast，3421 lncRNAs were identified to be different expression（fold change≥2.0）in AGEs treated fibroblast. 1079 were up⁃regulated and 2342 were down⁃regulated.448 lncRNAs（208 up⁃regulated and 240 down⁃regulated）were highly differentially expressed with absolute fold change greater than ten. ConclusionThe expression profile of lncRNA in AGEs treated fibroblast was significantly changed in comparsion with normal fibroblast.These lncRNA may be involved in the occurrence and development of diabetic dermopathy.

long noncoding RNA；advanced glycosylation end products；dermal fibroblast；diabetic dermopathy；diabetic foot

R394-3

A

10.3969/j.issn.1009⁃976X.2017.02.001

2017-03-10）

国家自然科学基金（81471034，81670764）

510120广州中山大学孙逸仙纪念医院内分泌科

*通讯作者：严励，Email：hfxyl@163.net