吴茱萸次碱的制备方法※

李 琦 曹青云 肖顺丽 王 敏 关亮俊 张宏桂

(北京中医药大学中药学院2015级硕士研究生，北京 100102)

制剂与质量控制

吴茱萸次碱的制备方法※

李 琦 曹青云 肖顺丽 王 敏 关亮俊 张宏桂△

(北京中医药大学中药学院2015级硕士研究生，北京 100102)

目的 以吴茱萸为原料，研究简单、快速、高效的分离、纯化吴茱萸次碱的制备方法。方法 采用85%乙醇提取，硅胶柱层析分离，甲醇重结晶纯化吴茱萸次碱，薄层鉴别(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、核磁方法检查纯度。结果 吴茱萸次碱经TLC检查与对照品一致，无杂质斑点，经HPLC检测纯度达98.5%以上，经核磁鉴定。另外经考察，确定色谱条件为Waters C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；检测波长225、290、215、365 nm；流动相乙腈-水溶液(50∶50)；进样量10 μL；柱温35 ℃；体积流量1.0 mL/min。结论 吴茱萸次碱对照品已达到中药质量检测用化学对照品技术要求，所采取的分离、纯化方法简单、安全、可行性强，成本低、效率高，可用于吴茱萸药材及其制剂的质量控制。

生物碱类;吴茱萸;化学;制备

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸Evodiarutaecarpa(Juss.) Benth.、石虎Euodiarutaecarpa(Juss.) Benth.Var.officinalis(Dode) Huang或疏毛吴茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth. Var.bodinieri(Dode) Huang的干燥近成熟果实，散寒止痛，降逆止呕，助阳止泻，用于厥阴头痛、寒疝腹痛、寒湿脚气、经行腹痛、脘腹胀痛、呕吐吞酸及五更泄泻[1]。近代医学研究证明吴茱萸有镇痛[2]、安神[3]、抗菌[4]、降血压[5]和抗缺氧[6]等药理作用。吴茱萸含有多种化学成分，其中生物碱类成分是吴茱萸的主要活性成分[7]。吴茱萸次碱是吴茱萸的主要活性成分之一，具有增加冠脉血流量[8]，舒张血管、降血压[9]，抗血小板聚集[10-11]，脑保护作用[12]，调节糖脂代谢[13]，抗癌、抗炎、抗溃疡、松弛非血管平滑肌、抗缺氧等药理作用[14]。昶国平等[15]分离周期长，且用丙酮重结晶，危害性大。为了研究更简单、快速、高效的分离、纯化吴茱萸次碱的制备方法，本试验用一次硅胶柱层析分离，甲醇重结晶的方法，高效率制得纯度在98.5%以上的吴茱萸次碱。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药 Waters 1525型高效液相色谱仪，Waters 2489型紫外可见检测器；色谱柱为Waters C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；薄层色谱及柱色谱用硅胶(青岛海洋化工厂)；色谱纯乙腈(Calipure进口分装)；吴茱萸药材购自云南昆明药材市场，经北京中医药大学张贵君教授鉴定为Evodiarutaecarpa(Juss.)Benth.的干燥近成熟果实。

1.2 方法

1.2.1 装柱 取200～300目硅胶1.5 kg溶于石油醚中，搅拌均匀后装入层析柱(φ15 cm×60 cm的玻璃层析柱)。石油醚为流动相，常压沉降硅胶1周备用。

1.2.2 提取与分离 取吴茱萸药材0.5 kg，用粉碎机稍加粉碎，装入10 L圆底烧瓶中，用10倍量石油醚脱油脂1次(2 h)，趁热过滤，得残渣和滤液，滤液回收石油醚，残渣再次放入圆底烧瓶中，用10倍量85%乙醇提取3次，每次2 h，合并3次提取液。将提取液浓缩至无醇味。加适量水，有大量沉淀析出，过滤，得黑绿色沉淀物101.12 g，于通风橱中挥干溶剂，减压干燥箱中干燥(55 ℃)24 h，研钵中研磨。细粉过80目筛后，直接干法上样，用石油醚-乙酸乙酯(v∶v,5∶1)洗脱，按照1滴/s的流速收集流分于圆底烧瓶中，500 mL后换瓶，流分至5 000 mL后开始有白色雪花状结晶析出，为吴茱萸次碱粗品。结合色带颜色收集流分，收集液(40 ℃)减压回收溶剂后，点硅胶板合并有相同目标物的流分。常温放置一段时间后得黄白色粗品1.2 g。

重结晶：将粗品用甲醇溶解成过饱和状态，放入冰箱中，低温重结晶，如此反复3次，干燥后即淡黄色吴茱萸次碱纯品0.5 g。

1.2.3 结构鉴定1H-NMR(500 MHz, CDCl3)，δ: 9.606(1H, br s, N-H-1), 8.327(1H, dd, J=1.5 Hz, J=8.0 Hz, H-19),7.763(1H, dt, J=1.5, J=8.0 Hz, J=8.5 Hz, H-17), 7.440(1H, d, J=8.0 Hz, H-16), 7.426(1H, d, J=8.0 Hz, H-9), 7.410(1H, d, J=8.5 Hz, H-12), 7.342(IH, d, J=8.0 Hz, H-18), 7.306(1H, t, J=8.0, 7.0 Hz, H-11), 7.147(1H, t, J=7.5, 7.5 Hz, H-10), 4.594(2H, t, J=7.0, 7.0 Hz,H-5), 3.239(2H, t, t=7.0, 6.5 Hz, H-6)，与文献的吴茱萸氢谱数据吻合[16]。

1.2.4 纯度测定

1.2.4.1 TLC检测 分别以石油醚-丙酮(5∶1)、石油醚-正丁醇(6∶1)、石油醚-乙酸乙酯(5∶2)为展开剂进行硅胶薄层层析。紫外灯365 nm下观察样品与对照品Rf比对。

1.2.4.2 高效液相色谱法 色谱条件，色谱柱：Waters C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水溶液 (50∶50)，按2015年版《中华人民共和国药典》[1]中的规定进行等度洗脱；流速：1.0 mL/min；检测波长：225、290、215、365 nm；柱温：35 ℃。在该色谱条件下，理论塔板数按照吴茱萸次碱峰计应不低于3 000。

取吴茱萸次碱适量，加甲醇溶解制成每1 mL含1 mg化合物的溶液，作为供试品，然后取空白溶剂(甲醇)和供试品溶液各10 μL，按上述色谱条件测定。

1.2.5 色谱条件考察

1.2.5.1 检测波长的考察 《中华人民共和国药典》[1]吴茱萸次碱的检测波长为215 nm，将215 nm作为吴茱萸次碱的检测波长。为了使吴茱萸次碱纯度确信，又选择225、290、365 nm检测波长[17-18]。

1.2.5.2 流量的考察 取吴茱萸次碱供试液适量，分别设置体积流量为0.8、1.0、1.2 mL/min，进行考察。

1.2.5.3 色谱柱的考察 取吴茱萸次碱供试液适量，以检测波长215 nm、柱温35 ℃、流动相甲醇-水(80∶20)、体积流量1 mL/min、进样量10 μL为色谱条件，分别采用Sunfire TM C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)、Agilent C8(4.6 mm×150 mm，5 μm)、Waters C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱进行测定。

1.2.5.4 柱温的考察 取吴茱萸次碱供试液适量，分别设置柱温为25、30、35 ℃，进行考察。

2 结 果

2.1 TCL检测结果 经3个展开系统方式检测时，TLC上均呈现单一斑点，而且未见杂质，且样品与对照品Rf相同。

2.2 HPLC检测结果 扣除溶剂干扰峰后，吴茱萸次碱的色谱峰面积归一化含有量在各波长均>99%，相应的样品与对照品出峰时间一致，在各个波长下的含量分别为215 nm的纯度为98.5%，在295 nm的纯度为99.1%，茱萸次碱225 nm的纯度为99.4%，在365 nm的纯度为99.6%说明样品的纯度符合化学对照品的质量要求，如图1所示。

注：(a)215 nm (b)225 nm (c)295 nm (d)365 nm

2.3 流量考察的结果 见表1。

表1 流量研究结果

由表1可见，当体积流量为1.0 mL/min时，对称因子和理论塔板数最高。

2.4 色谱柱考察结果 见表2。

表2 色谱柱考察结果

由表2可知，当色谱柱为HederaC18(4.6 mm×200 mm，5 μm)时，对称因子和理论塔板数最好。

2.5 柱温考察结果 见表3。

表3 柱温考察结果

由表3可知，当柱温为35 ℃时，基线稳定，对称因子最高。

3 讨 论

本方法在短时间里，应用简单且毒害低的提取分离方法，从吴茱萸中分离出符合2015年版《中华人民共和国药典》(一部)[1]标准的吴茱萸次碱对照品，而且路线简单可靠，可用于吴茱萸药材及其制剂的质量控制。

3.1 提取前的准备工作 吴茱萸含有很多小分子的脂溶性成分[19]，直接用乙醇提取，提取溶液特别黏稠，增加分离工作的负担，不利于后期处理。实验用乙醇提取之前，用石油醚脱脂，既减少油脂杂质，又为后期分离减轻工作量。

3.2 样品的处理 浓缩得到墨绿色沉淀后，昶国平等[15]选用二氯甲烷加热溶解，本试验在前人基础上选择用二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇以及甲醇与乙酸乙酯混合溶剂加热溶解，溶解度都非常小，浪费了大量的溶剂和时间，且二氯甲烷沸点低且毒性较大，导致头晕、头痛、恶心、呕吐、手脚麻木、疲劳、协调性降低以及眼和上呼吸道刺激症状，高浓度暴露可能导致共济失调、意识丧失甚至死亡[20]，增加了试验的不安全性。本试验最后采用样品直接上柱法，沉淀烘干后，打粉，过筛，上柱，免去硅胶分散干膏粉的传统工序，既节约试剂，又节约时间。在保证分离效果的前提下简化了分离工艺，节省了试剂和时间，提高了分离效率，降低了生产成本，保证试验的安全有效。

3.3 甲醇重结晶 昶国平等[15]采用丙酮重结晶，而本试验采用甲醇重结晶。丙酮在应用中极易发生泄漏、中毒、火灾、爆炸及环境污染等事故，对中枢神经系统的麻醉作用，出现乏力，恶心，头痛，头晕，易激动，重者发生呕吐、气急、痉挛，甚至昏迷，对眼、鼻、喉有刺激性[21]。用甲醇重结晶，一方面重结晶的次数减少，缩短了结晶的时间，另外减少对环境的污染，控制一些可变因素，增加试验的安全性。

3.4 波长的考察 昶国平等[15]用双波长检测吴茱萸次碱，225 nm的纯度为98.5%，在290 nm的纯度为98.8%。鲍天冬等[17]研究用高效液相色谱法同时测定制吴茱萸及其提取物中吴茱萸碱、吴茱萸次碱和吴茱萸内酯含量，选取225 nm作为检测波长。王世永等[18]研究吴茱萸中吴茱萸碱和次碱的提取及测定，选取290 nm作为检测波长。而本试验选取225、290、215、365 nm 4个波长检测，更能准确地反映真实纯度。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京:中国医药科技出版社,2015:171.

[2] 李晓宇,孙蓉.基于胃寒证的吴茱萸水提物镇痛及伴随毒副作用机制[J].中国中药杂志,2015,40(14):2753-2759.

[3] 芦霜,卢昕,陈民.加味吴茱萸散穴位贴敷治疗老年失眠临床观察[J].辽宁中医杂志,2011,38(12):2416-2417.

[4] 乔海霞,甄攀,李秀娟,等.吴茱萸提取物体外抗菌作用初步研究[J].河北北方学院学报：医学版,2009,26(1):27-29.

[5] 赵晓丽,李德森,吴水生,等.泽泻吴茱萸方对血管活性物质降血压作用机制实验研究[J].辽宁中医药大学学报,2011,13(8):204-206.

[6] 张明发,沈雅琴,许青媛.附子和吴茱萸对缺氧和受寒小鼠的影响[J].天然产物研究与开发,1990,2(1):23-27.

[7] 龙明立,张毅民,贺丽平,等.吴茱萸次碱的药理学研究进展[J].解放军药学学报,2008,24(6):528-531.

[8] Hu CP, Xiao L, Deng HW, et al.The cardiopmtectionof Rutaecaepine is mediated by endogenous calcitonin related-gene peptide through activation of vanillinreceptors inguinea- pig hearts[J].Planta Med, 2002,68(8):705-9.

[9] Yu J, Tan GS, Deng PY, et al. Involvement of CGRP in the inhibitory effect of rutaecarpine on vasoconstriction inducedby anaphylaxis in guinea pig[J].Regulatory Pept, 2005,125(1-3):93-97.

[10] Sheu JR, Hung WC, Lee YM, et a1. Mechanism of inhibition of platelet aggregation by rutaecarpine, an alkaloid isolated from Evodia rutaecarpa[J].Eur J Pharmacol,1996,318(2-3):469-475.

[11] Sheu JR, Kan YC, Hung WC,et al.The antiplatelet activity of rutaecarpine, an alkaloid isolated from Evodia rutaecarpa, is mediated through inhibition of phospholipase C[J].Thromb Res,1998,92(2):53-64.

[12] 严春临,张季,高艳青,等.吴茱萸次碱对脑缺血再灌注小鼠的保护作用及作用机制研究[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(6):264-266.

[13] 李莹莹.吴茱萸次碱通过激活CAR调节糖脂代谢的机制及其药动学研究[D].杭州：浙江大学,2016.

[14] 蔡雪映,孟楠,杨冰.服用吴茱萸过量致中毒1例分析[J].北京中医,2006,25(3):171-172.

[15] 昶国平,魏雅蕾,杨玉琴,等.吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的制备方法[J].现代中药研究与实践,2015,29(2):36-37.

[16] 孟娜,陈凤凰,惠斌,等.吴茱萸化学成分研究[J].贵州大学学报：自然科学版,2006,23(2):188-190.

[17] 鲍天冬,董宇,杨庆,等.高效液相色谱法同时测定制吴茱萸及其提取物中吴茱萸碱、吴茱萸次碱和吴茱萸内酯含量[J].中国实验方剂学杂志,2007,13(6):1-3.

[18] 王世永,李小定.吴茱萸中吴茱萸碱和次碱的提取及测定[J].湖北农业科学,2008,47(3):340-342.

[19] 崔晓秋.吴茱萸化学成分研究[D].长春：吉林农业大学,2004.

[20] 王海兰.二氯甲烷的职业危害与防护[J].现代职业安全,2013,(8):107-109.

[21] 王晶晶,陆书明.丙酮的工业安全应用研究现状[J].广东化工,2014,41(12):279-280.

(本文编辑：董军杰)

Preparation method of rutaecarpine

LIQi,CAOQingyun,XIAOShunli,etal.

2015-GradeMasterofChineseMedicineCollegeinBeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Beijing100102

Objective Using evodia as the material, to study a simple, rapid and efficient preparation method for the separation and purification of rutaecarpine. Methods The rutaecarpin were prepared by using 85% ethanol extraction, silica-gel column chromatography separation and methanol recrystallization purification. The purity was checked by thin layer identification (TLC), high performance liquid chromatography (HPLC) and nuclear magnetic resonance (NMR). Results Rutaecarpine was consistent with the reference substance upon TLC, without impurities and spots, the purity over 98.5% upon HPLC, which identified by NMR. In addition, the chromatographic conditions were determined as Waters C18column (150 mm × 4.6 mm, 5 μm), determine wavelengths: 225, 290, 215, 365 nm; moving phase: acetonitrile-aqueous solution (50∶50); sample size: 10 μL; column temperature: 35 ℃; volume flow rate: 1.0 mL/min. Conclusion Rutaecarpine reference substance has reached the technical requirements of Traditional Chinese medicine with chemical reference materials, the method for separation and purification is simple, safe, strong feasibility, low cost, high efficiency, can be used for the quality control of evodia medicinal materials and its preparations.

Alkaloids; Evodia; Chemistry; Preparation

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.03.031

※ 项目来源：国家自然科学基金资助项目(编号：30870262)

李琦(1991—)，女，硕士研究生在读。研究方向：中药有效物质基础研究。

R282.71;R284.1

A

1002-2619(2017)03-0439-05

2017-01-13)

△ 通讯作者：北京中医药大学中药学院科技发展部，北京 100102