针刀干预对帕金森病模型大鼠纹状体内去甲肾上腺素及5-羟色胺含量的影响

杜宁宇 芦 娟 郭长青 卢胜春 赵瑞利 徐 菁 张 伟 马薇薇 梁靖蓉

(北京中医药大学针灸推拿学院2014级硕士研究生，北京 100029)

针刀干预对帕金森病模型大鼠纹状体内去甲肾上腺素及5-羟色胺含量的影响

杜宁宇 芦 娟1郭长青△卢胜春2赵瑞利3徐 菁3张 伟4马薇薇 梁靖蓉

(北京中医药大学针灸推拿学院2014级硕士研究生，北京 100029)

目的 观察帕金森病模型大鼠纹状体内去甲肾上腺素(NA)、5-羟色胺(5-HT)的含量以及针刀干预后的变化，探讨针刀治疗帕金森病的作用机制。方法 成年健康雄性SD大鼠76只，随机分为2组，实验组60只，空白组16只。实验组60只采用右侧纹状体双靶点注射6-羟多巴胺(6-OHDA)造模，造模结束后用阿朴吗啡(APO)诱导法进行模型评价，并通过行为学检测，实验组共有48只大鼠造模成功，随机分为模型组、药物组和针刀组，每组16只。空白组和模型组正常抓取刺激，不进行干预治疗；药物组予美多芭片悬浊液治疗，每日1次，连续4周；针刀组进行松解干预，每周2次，连续4周。治疗结束1周后进行行为学评价，通过苏木精-伊红(HE)染色图片观察大鼠纹状体的病理学变化，通过高效液相色谱法观察大鼠纹状体NA、5-HT的含量。结果 行为学评价结果显示，空白组大鼠未见旋转，模型组大鼠出现旋转，干预后药物组及针刀组大鼠旋转圈数明显减少(P<0.01)，且治疗前后比较差异有统计学意义(P<0.01)。与空白组比较，模型组大鼠纹状体内NA、5-HT含量减少(P<0.05)；与模型组比较，药物组和针刀组大鼠纹状体中NA、5-HT含量显著增高(P<0.05)。结论 针刀对帕金森病模型大鼠的治疗作用可能与其松解颈部肌肉，改善局部血液循环，增加NA、5-HT的含量，从而减轻帕金森病的症状有关。

帕金森病；针刀；去甲肾上腺素；5-羟色胺

帕金森病(parkinson's disease,PD)又称“震颤麻痹”，目前是仅次于阿尔茨海默病(alzheimer's disease，AD)的第二大神经系统退行性疾病，临床上以静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态异常为主要特征，中老年人高发。因其病情会持续进展，并发症、致残率较高，严重影响患者的生活质量，是神经系统的第二大难治病[1]。2个多世纪的研究发现其主要病理改变为黑质、纹状体内多巴胺神经元的减少及神经元胞浆内大量的嗜酸性路易小体的累积[2]。目前，主要认为神经毒性、神经递质、氧化应激、基因变异、脑代谢失常、内质网应激等与PD发病密切相关[3]。现阶段PD的治疗手段有：药物治疗、手术治疗、基因治疗、康复训练、饮食治疗等[4]。随着微创疗法在临床的发展和普及，建立在传统“九针”基础上的创新针具针刀，近年来发展迅速[5]。临床实践表明通过针刀系统治疗可显著改善患者症状，提高其生活质量[6-7]。本实验通过大鼠右侧纹状体双靶点注射6-羟多巴胺(6-OHDA)制备PD模型，通过检测并分析大鼠纹状体内单胺类神经递质去甲肾上腺素(NA)、5-羟色胺(5-HT)的含量变化，探索针刀治疗PD的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级SD大鼠76只，雄性，体质量200～220 g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号：SCXK(京)2015-0001。动物分笼，在安静、避强光且通风的SPF级实验室内饲养，饲养温度18～25 ℃，湿度35%～37%，自然光线，自由进食和饮水。

1.2 药物及试剂 NA、5-HT、磷酸二氢钠(NaH2PO4)、柠檬酸(CA)、乙二胺四乙酸四钠盐(EDTA)均为AR级，美国Sigma公司；辛烷基磺酸钠(OSA)为HPLC级，美国Sigma公司；乙腈(ACN)为HPLC级，美国Fisher Scientific公司；高氯酸(HClO4)、硫代硫酸钠(Na2S2O3)均为国产AR级，南京化学试剂有限公司。

1.3 主要仪器 16通道Coularray库仑阵列电化学高效液相色谱仪及色谱工作站、5600A电化学检测器、582二元泵体系、542自动进样器、5040型固态微孔电极(铂电极、固态钯电极)、6210碳石墨电极、CH150型柱温箱、ACH-SPR柱后固定化酶反应器、ACH-3色谱柱(3.2 mm×150 mm 3 μm、C184.6 mm×150 mm 5 μm)，均为美国ESA公司；MIKRO 22R离心机，德国Hettich公司；低温冰箱，法国JOUAN公司；针筒式微孔滤膜过滤器：水系(0.22 μm)，天津腾达过滤器厂；大脑立体定位仪，美国Stoelting公司；汉章系列一次性针刀(规格0.4 mm×40 mm)，北京卓越华友医疗器械有限公司。

1.4 造模与分组 成年健康雄性SD大鼠76只，随机分为2组，实验组60只，空白组16只。造模前禁食12 h，采用右侧纹状体双靶点注射法。以10%的水合氯醛腹腔内注射(4 mL/kg)麻醉大鼠，待麻醉完全后用剃毛机剔除颅顶部鼠毛，将动物头部固定在大脑立体定位仪上，使其头部保持颅平位，示指稍用力向下按压大鼠头部而未从耳杆中脱落为固定牢固。头部备皮碘伏消毒后，用手术刀片在右耳前做长1.5 cm的切口，处理切口面至暴露出前囟，确定前囟坐标。按照《大鼠脑立体定向图谱》[8]定位右侧纹状体2个注射点坐标:第1点为前囟前0.7 mm，矢状线右侧3.0 mm，硬膜下4.5 mm；第2点为前囟后0.2 mm，中线右侧2.6 mm，硬膜下6.0 mm[9]，以小号牙科球形钻头按上述坐标钻孔，当出现突破感时立即停止，用10 μL微量注射器刺破骨膜，以0.5 μL/min速度分别向每点注射6-OHDA 15 μg(溶于3 μL含0.2%维生素C的0.9%氯化钠注射液中)，注毕留针10 min，然后以1 mm/min的速度缓慢退针，用明胶海绵填塞钻孔，缝合[10]。为防感染，造模结束后腹腔注射青霉素钠8万单位。注意术后保暖,室温25～28 ℃，在其苏醒前应密切观察动物全身情况，清醒后单笼饲养。实验组大鼠术后有2只死亡，其余均存活良好，未出现明确的手术并发症。

实验组于术后第6周腹腔注射0.01%阿朴吗啡(APO)0.5 mg/kg，于5 min后开始观察并记录1 h内大鼠旋转的启动时间、持续时间、启动后的旋转圈数。首见短暂木僵、首尾相接，一般于注射后5～20 min内出现以左侧后肢为支点原地向左转动，先慢后快等行为学表现。部分大鼠伴有震颤、嗅探、觅食、步态不稳、少动等异常行为。向健侧旋转平均转速>7 转/min视为造模成功。通过行为学检测和模型评价，实验组共有48只大鼠造模成功。

1.5 干预方法 将实验组造模成功的48只大鼠随机分为模型组、药物组和针刀组，每组16只，空白组16只，共64只。药物组：美多芭片(即多巴丝肼片)按照50 mg/kg剂量，用研钵研碎后溶于0.9%氯化钠注射液中，配制成悬浊液，为大鼠药物，每日1次，连续给药4周。针刀组：以龙胆紫定位寰椎、枢椎横突点，常规备皮、消毒，选用HZ系列一次性针刀，规格0.4 mm×40 mm(北京卓越华友医疗器械有限公司)，进针时刀口线与大鼠身体纵轴平行，刀体与皮肤切面垂直刺入，针刺至枕骨骨面和寰椎、枢椎横突处，当刀刃接触骨面时，纵行疏剥2次，出针并按压片刻止血。每周2次，连续治疗4周。

1.6 观察指标

1.6.1 中脑黑质HE染色 治疗结束后每组随机选取8只大鼠进行灌注取脑。先用10%的水合氯醛进行腹腔麻醉，待充分麻醉后打开胸腔，充分暴露心脏。先将右心耳用止血钳固定，再剪开一小口，将灌注针插入，向心脏快速灌入100 mL 0.9%氯化钠注射液，待右心耳流出无色液体后改用4%多聚甲醛固定液灌注，直至大鼠四肢僵硬，躯体反弓，鼠尾挺直，爪甲变白等。灌注成功后快速冰上取脑，置于4%多聚甲醛固定液待测。标本经固定后，石蜡包埋，切片(5 μm)，脱蜡，染色。常规脱水，中性树脂封片。

1.6.2 各组大鼠纹状体NA、5-HT含量检测 将每组剩余的8只大鼠纹状体进行匀浆。用10%的水合氯醛腹腔麻醉，待其麻醉充分后，迅速断头处死，开颅取出脑组织，低温条件下分离出右侧纹状体，称质量后置于-70 ℃液氮中待测。将样品制成100 g/L组织匀浆，离心机3 000 r/min离心15 min，取上清液。流动相：NaH2PO490 mmol/L，CA 50 mmol/L，OSA 1.7 mmol/L，EDTA 0.05 μmol/L。上述溶液以0.2 μm水系膜过滤，滤过液中加入乙腈(10%)。流速：0.6 mL/min，电势，工作电极1：-150 mV、工作电极2：450 mV、工作电极3：500 mV、工作电极4：550 mV，柱温：25℃。自动进样器每次进样10 μL，以峰面积计算浓度。

2 结 果

2.1 各组中脑黑质HE染色光镜结果 空白组：神经元细胞形态完整，细胞核呈圆形或锥形，神经纤维排列较为整齐、致密。模型组：神经元细胞轻度肿胀，细胞核形态不规则，核仁不明显，神经纤维排列较紊乱、疏松。药物组：与模型组比较神经元肿胀减轻，体积变小，细胞间隙变窄，细胞形态较规则，神经纤维排列较模型组整齐。针刀组：形态结构接近正常，细胞肿胀减轻，神经纤维排列较整齐。见图1。

图1 各组中脑黑质HE染色光镜结果(HE，×200)

2.2 各组治疗前后大鼠旋转行为测定结果比较 见表1。

由表1可见，空白组大鼠未出现旋转行为；模型组出现旋转行为，且治疗前后比较差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，治疗后药物组、针刀组大鼠旋转圈数减少(P<0.01)，且药物组及针刀组与本组治疗前比较差异有统计学意义(P<0.01)；治疗后针刀组与药物组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组治疗前后大鼠旋转行为测定结果比较 转

与本组治疗前比较， *P<0.01；与模型组治疗后比较，△P<0.01

2.3 各组大鼠纹状体内NA、5-HT含量比较 见表2。

组 别nNA5-HT空白组8170.19±27.54△51.07±10.80△模型组8103.69±28.90*28.65±15.41*药物组8144.24±35.82*△43.44±8.20△针刀组8134.17±19.97△44.96±8.39△

与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05

由表2可见，与空白组比较，模型组大鼠纹状体中NA、5-HT的含量明显下降(P<0.05)，说明PD造模成功后大鼠纹状体内NA含量低于正常水平。与空白组比较，药物组大鼠纹状体中NA的含量差异有统计学意义(P<0.05)，针刀组大鼠纹状体中NA的含量无统计学意义(P>0.05)，药物组、针刀组纹状体中5-HT的含量与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)；与模型组比较，药物组、针刀组的NA、5-HT含量显著升高(P<0.05),说明经针刀治疗后NA、5-HT含量接近正常水平，但药物组与针刀组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

PD是一种中枢神经系统退行性疾病，受损部位常为黑质-纹状体内，多因神经功能受损导致单胺类神经递质与乙酰胆碱平衡失调而引发疾病。其病理改变主要是黑质-纹状体系统单胺类神经递质的减少伴有基底节神经核团的功能改变[11]。临床观察发现，大多数PD患者伴有脑部血流量减少,基底节黑质-纹状体系统尤为明显，血流量减少与临床症状波动有密切关系[12]。有研究表示，颈部的软组织病变可能直接或间接影响颈上交感神经,引起枕后区域供血障碍，致使单胺类神经递质的合成原料不足，从而引起一系列的PD症状[13]。目前，国际神经科学界一致认为PD治疗的理想目标是控制疾病症状，提高患者的生活质量，延缓病程进展及减少药物的不良反应和并发症[14]。近年来针刀治疗PD在临床中取得了可靠且无毒副作用的疗效，充分体现了针刀治疗PD的特点及优势，具有重要的研究意义。本实验选取大鼠枕骨骨面和颈椎(C)1、C2横突处作为治疗点，通过针刀松解颈部肌肉，检测单胺类神经递质的含量，以期为控制PD症状提供理论依据。

本实验采用脑内右侧纹状体定向注射6-OHDA建立PD大鼠模型，以6-OHDA作为神经毒性物质，进入脑内被纹状体多巴胺能神经元摄取后，在单胺氧化酶的作用下转化成自由基造成神经元不可逆损伤并死亡[15]。相较于用腹腔注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)所建立的PD小鼠模型，该模型通过药物损毁纹状体，导致黑质细胞死亡，引发黑质-纹状体通路功能减退，出现的行为学改变比较稳定，不易出现神经元功能自行恢复。且实验对象价格便宜容易获取，个体较小鼠方便针刀定位治疗及取脑研究[16]。

由于脑内黑质-纹状体内的单胺类神经元减少是引起PD临床症状的主要因素，而NA、5-HT在纹状体中的含量又相对较高，因而我们采用高效液相色谱法观察纹状体内相关神经递质NA、5-HT的含量变化，以评估不同治疗手段干预后对PD模型大鼠脑内神经递质的影响。NA是作为哺乳动物的神经递质而发挥生物活性，不仅是交感神经末梢的递质，而且还是重要的中枢神经递质。NA对中枢神经元的作用较为复杂，既有抑制作用，也有兴奋作用。研究证明，黑质-纹状体通路变性可导致脑内5-HT递质系统发生改变，包括5-HT能神经元的缺失、5-HT递质水平的下降和5-HT受体表达的变化等[17]。本实验通过黑质HE染色切片观察到模型组神经元细胞肿胀，细胞核形态不规则，核仁不明显，神经纤维排列较紊乱、疏松，经过针刀治疗后神经元细胞形态结构接近正常，细胞肿胀减轻，神经纤维排列较整齐。通过高效液相色谱法检测到，模型组大鼠纹状体内NA、5-HT含量较空白组减少(P<0.05)，药物组、针刀组大鼠纹状体中NA、5-HT含量较模型组显著增高(P<0.05)。说明针刀能够缓解PD症状，可能与松解颈部肌肉，减轻其对颈上交感神经的刺激、卡压，使颈部挛缩的血管舒张，改善局部供血，增加单胺类神经递质的合成原料，促进纹状体中NA、5-HT释放有关。美多芭是目前治疗PD的主要药物之一，该药物能有效改善PD患者的运动障碍症状[18]。针刀对模型大鼠的治疗作用与一线治疗药物美多芭的疗效虽然无统计学意义，但治疗效果相近且稳定，同时又避免了药物副作用的产生，适合在临床推广。本次实验还未涉及单胺类神经递质相关代谢指标的具体起效时间、起效通路以及相关蛋白、基因以及颈部肌组织局部血液流变学等指标，还有很大的研究空间，故仍值得我们继续研究，以期为临床针刀治疗PD提供更加明确的起效机制和理论依据。

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(本文编辑：董军杰)

Effects of Needle-knife intervention on striatum norepinephrine and 5-hydroxytryptamine in Parkinson's disease rats

DUNingyu*,LUJuan,GUOChangqing,etal.

*2014-GradeMasterofAcupunctureandMassageCollege,BeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Beijing100029

Objective To observe the normal contents of striatum norepinephrine (NA) and 5-hydroxytryptamine (5-HT) and its changes after needle-knife intervention, to explore the mechanism of needle-knife on the treatment of Parkinson's disease. Methods 76 adult healthy male SD rats were randomly divided into the experimental group (n=60) and the blank group (n=16). The models of Parkinson's disease in experimental group were induced by double target injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) into right apomorphine (APO) and behavior test, finally 48 rats with successful modeling were randomly divided into model group, medicine group and needle - knife group, 16 rats in each group.The blank group and model group received normal garb stimulation with no intervention.The medicine group received medopar tablet suspension once daily, continuously treatment for 4 weeks.The needle - knife group received relax intervention, 2 times per week for 4 weeks. The behavioral evaluation was performed 1 week after the end of treatment, the pathological changes of rats' striatum were observed by hematoxylin - eosin (HE) staining, the contents of striatum NA and 5-HT were observed by high performance liquid chromatography. Results The behavioral evaluation showed that there was no rotation in blank group, the rotation appeared in the model group, the revolutions after intervention in medicine group and needle - knife group were significantly decreased (P<0.05), and there were significant differences between before and after treatment (P<0.01). As compared with the blank group, the striatum NA and 5-HT in model group were obviously decreased (P<0.05); As compared with the model group, the striatum NA and 5-HT in medicine and needle - knife group were significantly increased (P<0.05). Conclusion Needle - knife intervention has therapeutic effects on Parkinson's model rats, which may be related with its effects of relaxing neck muscles, improving local blood circulation and increasing NA and 5-HT, thus alleviating the symptoms of Parkinson's disease.

Parkinson's disease; Needle -knife; Norepinephrine; 5-HT

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.03.025

杜宁宇(1990—)，女，硕士研究生在读。研究方向：针刀理论与临床研究。

R-332;R245-33;R745.705

A

1002-2619(2017)03-0415-05

2017-01-19)

△ 通讯作者:北京中医药大学针灸推拿学院，北京 100029

1 北京中医药大学针灸推拿学院2014级博士研究生，北京 100029

2 江西省德兴市胜春医院，江西 德兴 334200

3 北京中医药大学针灸推拿学院2015级硕士研究生，北京 100029

4 北京中医药大学针灸推拿学院2015级博士研究生，北京 100029