非小细胞肺癌患者外周血中辅助性T细胞17与调节性T淋巴细胞平衡变化的研究

刘爱民

·论著·

非小细胞肺癌患者外周血中辅助性T细胞17与调节性T淋巴细胞平衡变化的研究

刘爱民

目的 观察非小细胞肺癌患者外周血中辅助性T细胞17(Th17)与调节性T淋巴细胞(Treg)平衡关系变化，研究其在非小细胞肺癌发病中机制作用。方法 45例非小细胞肺癌患者(观察组)应用流式细胞术检测Th17与Treg平衡关系，并设健康体检者45例作为对照组进行对比观察。结果 观察组Th17表达为(3.51±0.37)%，对照组Th17表达为(2.21±0.35)%，观察组Th17表达明显高于对照组(P<0.05)。观察组中腺癌(22例)、鳞癌(23例)及局限期(Ⅰ～Ⅲ期)(15例)、进展期(Ⅳ)(30例)Th17表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。观察组Treg表达为(7.82±1.45)%，对照组Treg表达为(4.34±1.05)%，观察组Treg表达明显高于对照组(P<0.05)。观察组中进展期(Ⅳ期)Treg表达为(8.12±1.54)%，局限期(Ⅰ～Ⅲ期)Treg表达为(7.01±1.34)%，2期比较差异有统计学意义(P<0.05)，进展期Treg表达高于局限期。观察组中腺癌患者与鳞癌患者Treg表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。观察组Treg/Th17为(2.41±0.84)，对照组Treg/Th17为(2.02±0.44)，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)，观察组Treg/Th17高于对照组。观察组中进展期(Ⅳ期)Treg/Th17为(2.62±0.69)，局限期(Ⅰ～Ⅲ期)Treg/Th17为(2.01±0.54)%，2期比较差异有统计学意义(P<0.05)，进展期Treg/Th17高于局限期。结论 非小细胞肺癌患者存在Treg/Th17失衡，且其比值变化与预后具有相关性。

非小细胞肺癌；外周血中辅助性T细胞17；调节性T淋巴细胞；机制研究

肺癌是呼吸系统的常见肿瘤，其发病率及病死率逐年上升，是目前世界上威胁人类生命的头号杀手[1]。肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，不仅发病率和病死率高，且5年生存率<15%，世界卫生组织(WHO)2001年公布的资料显示，在过去10年间肺癌发病人数约120万/年，死亡人数约110万/年，为全球最主要的癌症[2]。2008年以来，肺癌的发病率和死亡率已经超过乳腺癌、结肠癌、胃癌和肝癌，严重危害人类的健康，成为一个严重的公共健康问题[3,4]。调节性T淋巴细胞(Treg)为免疫调节细胞，主要作用是维持内环境动态平衡，是通过接触分泌抑制转化生长因子-β(TGF-β)及白细胞介素-10(IL-10)负向调节反应来实现的[5]。外周血中辅助性T细胞17(Th17)为辅助性淋巴细胞，主要通过IL-6及TGF-β的诱导分化产生[6]。Treg、Th17在生物学及分化方面有相互拮抗作用，在肿瘤免疫中Treg/Th17的动态平衡有重要意义[7]。我们应用流式细胞术检测非小细胞肺癌Th17、Treg表达及Treg/Th17的变化，研究Treg/Th17在非小细胞肺癌发病中的作用机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2015年4月至2016年9月我院肿瘤科门诊非小细胞肺癌患者45例为观察组，男26例，女19例；年龄50～62岁，平均(56.18±6.70)岁；病程3～8个月，平均(6.23±1.35)个月；腺癌22例，鳞癌23例；分期：局限期(Ⅰ～Ⅲ期)15例，进展期(Ⅳ)30例。同时选择同期在我院健康体检者45例为对照组，男24例，女21例；年龄49～60岁，平均(55.32±6.26)岁。2组性别比、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 诊断及纳入标准

1.2.1 诊断标准:①经细胞学或病理学诊断为非小细胞肺癌(分为肺癌Ⅰ～Ⅳ期)；②Kamofsky(KPS)评分≥60分；③具有≥3个症状(即疼痛，疲劳，慢性恶心和厌食/恶病质，睡眠问题，抑郁，或食欲不振)；④埃德蒙顿症状评估量表有3个或3个以上条目的平均强度≥4(ESAS，为0至10分)[8]。

1.2.2 纳入标准:符合诊断标准者；入组治疗期间未接受放疗、化疗者；无感染患者；血红蛋白(HGB)≥90μg/L；预计生存时间>3个月；未接受孕激素、肾上腺皮质激素及代谢激素治疗；无严重心脏病及糖尿病史、无消化道梗阻、营养吸收障碍和血栓现象；未接受肠内或肠外高营养。

1.3 观察指标及方法

1.3.1 仪器与试剂：CD3PE-Cy5抗体、CD4FITCPE抗体、CD8AFITC抗体、CD25APC抗体、人Treg染色体试剂盒、Foxp3抗体及同型对照IgG2，均购自美国eBioscience公司；佛波酯、离子霉素、布雷菲德菌素A、FIX&PERM试剂盒均购自美国ENZO公司；淋巴细胞分离液(Ficoll-Hypaque)、流式细胞仪分析仪为美国BD公司产品；固定破膜剂购自美国Invitrogen公司。

1.3.2 标本收集及保存：受试者(均未接受放化疗及手术治疗前者)清晨空腹状态下采集外周静脉血 4ml，分为2份，每份2ml，分别加入肝素钠抗凝管中，离心20min，分离出单核细胞。

1.3.3Th17细胞流式细胞术测定：将2ml静脉血肝素抗凝分离出单核细胞溶液加入布雷菲得菌素A、离子霉素、佛波酯工作液中，然后将试管放入细胞培养箱中，37℃条件下培养5h，培养后的培养液分2份，均为100μl，分别置于2个流式管中，即Th17细胞管和同型对照管，并做好标记。在Th17细胞管和同型对照管中均加入推荐量CD3及CD8抗体，室温避光15min后再采用流式细胞仪进行检测。

1.3.4Treg细胞流式细胞术测定：将2ml静脉血肝素抗凝分离出单核细胞溶液加入CD25抗体5μl和CD4抗体20μl，混合均匀后室温避光15～20min，然后再分别加入1ml固定/破膜稀释液，4℃避光30min，之后将2支试管均离心，弃去上清液，再加入胞膜内结合的免疫荧光Foxp3-PE抗体5μl，将对照管加入IgG2α抗体，避光30min后进行胞膜内免疫荧光标记，最后应用流式细胞仪分析。

2 结果

2.1 2组外周血Th17、Treg表达及Treg/Th17比较 观察组Th17表达为(3.51±0.37)%，对照组Th17表达为(2.21±0.35)%，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)，观察组Th17表达明显高于对照组。观察组Treg表达为(7.82±1.45)%，对照组Treg表达为(4.34±1.05)%，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)，观察组Treg表达明显高于对照组。观察组Treg/Th17为(2.41±0.84)，对照组Treg/Th17为(2.02±0.44)，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)，观察组Treg/Th17高于对照组。见表1。

组别Th17表达(%)Treg表达(%)Treg/Th17观察组3.51±0.37*7.82±1.45*2.41±0.84*对照组2.21±0.354.34±1.052.02±0.44

注: 与对照组比较，*P<0.05

2.2 观察组腺癌患者、鳞癌患者外周血Th17、Treg表达及Treg/Th17比较 观察组中腺癌(22例)Th17表达为(3.41±0.45)%，鳞癌(23例)Th17表达为(3.21±0.48)%，腺癌患者与鳞癌患者Th17表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。观察组中腺癌Treg表达为(8.01±1.90)%，鳞癌患者Treg表达为(7.78±1.22)%，腺癌患者与鳞癌患者Treg表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。观察组中腺癌Treg/Th17为(2.35±0.82)，鳞癌患者Treg/Th17为(2.36±0.70)，腺癌患者与鳞癌患者Treg/Th17比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

类别Th17表达(%)Treg表达(%)Treg/Th17腺癌患者(n=22)3.41±0.458.01±1.902.35±0.82鳞癌患者(n=23)3.21±0.487.78±1.222.36±0.70

2.3 观察组中局限期、进展期患者外周血Th17、Treg表达及Treg/Th17比较 观察组中局限期(Ⅰ～Ⅲ期)(15例)Th17表达为(3.36±0.54)%，进展期(Ⅳ)(30例)Th17表达为(3.46±0.42)%，局限期患者与进展期患者Th17表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。观察组中进展期(Ⅳ期)Treg表达为(8.12±1.54)%，局限期(Ⅰ～Ⅲ期)Treg表达为(7.01±1.34)%，2期比较差异有统计学意义(P<0.05)，进展期Treg表达高于局限期。观察组中进展期(Ⅳ期)Treg/Th17为(2.62±0.69)，局限期(Ⅰ～Ⅲ期)Treg/Th17为(2.01±0.54)%，2期比较差异有统计学意义(P<0.05)，进展期Treg/Th17高于局限期。见表3。

类别Th17表达(%)Treg表达(%)Treg/Th17局限期患者(n=15)3.36±0.547.01±1.34*2.01±0.54*进展期患者(n=30)3.46±0.428.12±1.542.62±0.69

注: 与对照组比较，*P<0.05

3 讨论

观察结果表明，2组Th17表达比较差异有统计学意义(P<0.05)，观察组Th17表达明显高于对照组；观察组中腺癌、鳞癌患者及局限期(Ⅰ～Ⅲ期)、进展期(Ⅳ)患者Th17表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。2组Treg表达比较差异有统计学意义(P<0.05)，观察组Treg表达明显高于对照组；观察组中进展期(Ⅳ期)、局限期(Ⅰ～Ⅲ期)患者Treg表达比较差异有统计学意义(P<0.05)，进展期Treg表达高于局限期。观察组中腺癌患者与鳞癌患者Treg表达比较差异无统计学意义(P>0.05)。2组Treg/Th17比较差异有统计学意义(P<0.05)，观察组Treg/Th17高于对照组。观察组中进展期(Ⅳ期)、局限期(Ⅰ～Ⅲ期)Treg/Th17比较差异有统计学意义(P<0.05)，进展期Treg/Th17高于局限期。说明Th17、Treg细胞在非小细胞肺癌的发生、发展中具有重要意义，患者存在Treg/Th17增高，且其比值变化与预后具有相关性，反映预后的负性指标，调节Treg/Thl7的比例可作为免疫治疗的一种新的方向。

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6DuanMC,HanW,JinPW,etal.DisturbedTh17/TregBalanceinPatientswithNon-smallCellLungCancer.Inflammation,2015,38:2156-2165.

7DuanMC,HanW,JinPW,etal.DisturbedTh17/TregBalanceinPatientswithNon-smallCellLungCancer.Inflammation,2015,38:2156-2165.

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10.3969/j.issn.1002-7386.2017.08.030

056001 河北省邯郸市中心医院门诊部

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