藏鸡蛋卵白蛋白酶解制备抗氧化肽及其体外抗氧化活性

池福敏 水雨航 江帆 刘柳 辜雪冬 +罗章

摘要：采用碱性蛋白酶水解藏鸡蛋卵白蛋白，制备抗氧化活性肽，以水解度和超氧阴离子自由基（O-2[KG-*2]· [KG-*3]）清除率为指标，通过单因素试验和正交试验确定最佳酶解参数，并对酶解多肽的体外抗氧化活性进行测定。结果表明：碱性蛋白酶酶解的最适条件为底物质量分数2%、酶解时间5 h、酶添加量7 000 U/g；在最适条件下，碱性蛋白酶酶解所得抗氧化肽的O-2[KG-*2]· [KG-*3]、DPPH自由基、羟基自由基（·OH）清除率分别为71.75%、56.47%、84.46%；还原力、抗脂质过氧化能力分别为0.87、82.83%。

關键词：藏鸡蛋；卵白蛋白；多肽；抗氧化活性；碱性蛋白酶

中图分类号： TS253.1文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）03-0144-04

收稿日期：2016-08-03

基金项目：西藏自治区自然科学基金（编号：2015ZR-14-30）；国家自然科学基金地区科学基金（编号：31560492）。

作者简介：池福敏（1985—），女，硕士研究生，讲师，主要从事高原特色食品加工研究。E-mail：chifumin2008@163.com。

藏鸡生活在我国青藏高原海拔2 200～4 100 m的半农半牧区、雅鲁藏布江中游流域河谷区、藏东三江中游高山峡谷区等区域，其生活环境相对封闭，几乎无污染，因此藏鸡蛋具有天然绿色的优势。巴桑等、陈烽烽等研究表明，藏鸡蛋中粗蛋白质、粗脂肪、铁、锌、钙的含量均高于普通鸡蛋，具有比普通鸡蛋更高的营养价值[1-2]。藏鸡蛋具有绿色天然、营养价值高等优点，开发利用前景广阔。

卵白蛋白是鸡蛋蛋清中一种重要的蛋白质，占蛋清中蛋白质的50%以上，含人体必需的8种氨基酸，是获得抗氧化肽、抗菌肽、免疫肽、降血压肽等生物活性肽的良好资源[3-6]。其中，抗氧化肽不仅具有多肽产品的营养作用，还具有抗氧化和清除体内自由基的功能，可增强人体抗衰老、抗疾病的能力[7-8]。

目前，国内外已有关于卵白蛋白抗氧化肽的研究报道。Davalos等研究发现，采用胃蛋白酶水解卵白蛋白可得到4种抗氧化肽，且4种肽的序列均包含在卵白蛋白序列中[9]。徐明生系统研究了卵白蛋白的提取和酶解制备抗氧化肽的工艺条件，并首次采用多种抗氧化活性试验，全面研究了鸡蛋卵白蛋白酶解物的抗氧化活性[10]。沈勇根等用胃蛋白酶水解卵白蛋白，采用超滤、离子色谱、反相高效液相色谱法从卵白蛋白酶解液中分离制备抗氧化肽，得到抗氧化力较强的3个肽[11]。Chen等研究了不同酶酶解鸡蛋清获得水解物的抗氧化活性，发现木瓜蛋白酶的酶解物具有最强的DPPH自由基清除力[12]。薛海燕等采用胃蛋白酶水解卵清蛋白，通过单因素和正交试验确定了酶解的最佳条件[13]。然而目前，有关藏鸡蛋卵白蛋白抗氧化肽的研究尚未见报道。本试验以藏鸡蛋卵白蛋白为材料，采用碱性蛋白酶水解藏鸡蛋卵白蛋白制备抗氧化肽，探讨最佳的水解条件，同时对其抗氧化活性进行测定，以期为以藏鸡蛋卵白蛋白为原料的抗氧化肽及其他生物活性肽的进一步研究提供依据。

1材料与方法

1.1材料

藏鸡蛋购自西藏自治区林芝市农贸市场；碱性蛋白酶（活力单位≥10 000 U/g）、Trolox、考马斯亮蓝G-250、DPPH均购自Sigma公司；三羟甲基氨基甲烷购自Amresco公司；大豆卵磷脂（BR）购自科密欧化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

AL104型电子分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]，UPH-II-10L型实验室超纯水机（成都优越科技有限公司），电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），R134a型冷冻离心机（德国艾本德股份公司），KPN型凯氏定氮仪（浙江托普仪器有限公司），JK-500DB型数控超声清洗器（合肥金尼克机械制造有限公司），ZD-F12型冷冻干燥机（郑州比朗仪器有限公司），UV-2102 PCS型紫外可见分光光度计[尤尼柯（上海）仪器有限公司]，99-1型大功率磁力搅拌器（常州国华电器有限公司）。

1.3方法

1.3.1卵白蛋白的制备

按照傅冰等的方法[14]从藏鸡蛋中提取卵白蛋白，制成藏鸡蛋卵白蛋白冻干粉，保存备用。

1.3.2碱性蛋白酶酶解试验设计

参照秦婧的前处理方法[15]，主要对碱性蛋白酶水解藏鸡蛋卵白蛋白时的底物质量分数、水解时间、酶的添加量进行单因素试验和正交试验，通过测定酶解液的O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率和水解度来判断各因素对酶解效果的影响。

单因素试验中各因素的具体情况如下。底物质量分数：分别设定底物质量分数为2%、3%、4%、5%、6%，在酶解时间为4 h、加酶量为8 000 U/g的条件下进行酶解。酶解时间：分别设定水解时间为2、3、4、5、6 h，在底物质量分数为3%、加酶量为8 000 U/g的条件下进行酶解。酶的添加量：分别设定酶的添加量为6 000、7 000、8 000、9 000、10 000 U/g，在底物质量分数为3%、时间为4 h的条件下进行酶解。

在单因素试验结果的基础上，对3个因素进行L9（34）正交设计试验（表1），确定最佳酶解参数。

1.3.3检测指标

O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率采用任娜等的方法[16]进行测定。水解度的计算公式为：水解度=[SX（]氨基态氮总氮[SX）]×100%。采用甲醛滴定法[10]进行氨基态氮测定，采用凯氏定氮法[17]进行总氮测定。

1.3.4最优组合验证

对“1.3.2”节正交试验中最优组合得到的产物进行验证，检测指标包括O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率、DPPH自由基清除率、·OH清除力、还原力、抗脂质过氧化能力。其中，O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率采用任娜等的方法[16]进行测定，DPPH自由基清除率、抗脂质过氧化能力采用秦婧的方法[15]进行测定，·OH清除力采用杨红澎等的方法[18]进行测定，还原力采用许效群等的方法[19]进行测定。

2结果与分析

2.1碱性蛋白酶水解单因素试验结果

2.1.1底物质量分数对酶解效果的影响

由图1可知，随着底物质量分数的增加，酶解产物的O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率先逐渐上升，在3%时达到最大值后下降，此后又逐渐上升，整体呈现不规则的形式。随着底物质量分数的增加，酶解产物的水解度则呈先增加、后减小的趋势，当底物质量分数为3%时水解度最大。综合两者进行分析，3%为最佳的底物质量分数，此时O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率为50.35%，水解度为59.64%。

[TPCFM1.tif][FK）]

2.1.2酶解时间对酶解效果的影响

由图2可知，随着酶解时间的延长，酶解产物的O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率逐渐增加，在4 h达到最大值后下降，但在6%时再次上升。酶解产物的水解度随着酶解时间的延长逐渐上升，在4 h后上升趋势平缓。综合两者[CM（25]进行分析，确定4[KG*3]h为最佳水解时间，此时O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率为[CM）]

[TPCFM2.tif；S+2mm][FK）]

47.11%，水解度为49.83%。

2.1.3加酶量对酶解效果的影响

由图3可知，随着酶添加量的增加，酶解产物的O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率和水解度均呈先增加、后减小的趋势，两者均在加酶量为8 000 U/g时达到最大值，此时O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率为55.86%，水解度为55.31%。

[FK（W12][TPCFM3.tif；S+3mm][FK）]

2.2碱性蛋白酶正交试验结果

碱性蛋白酶酶解卵白蛋白正交试验结果见表2。O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除能力、水解度的方差分析分别见表3、表4。

由表2可知，碱性蛋白酶酶解卵白蛋白试验中，各考察因素对O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除能力的影响大小顺序为C（加酶量）>B（酶解时间）>A（底物质量分数），最优组合为A1B3C1，即底物质量分数2%、酶解时间5 h、加酶量7 000 U/g；各考察因素对水解度的影响大小顺序为C（加酶量）>A（底物质量分数）>B（酶解时间），最优组合为A3B1C2，即底物质量分数4%、酶解时间3 h、加酶量8 000 U/g。

由表3、表4可知，各考察因素中，底物质量分数、酶解时间、加酶量对O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率和水解度的影响均不显著。

通过对2个指标的极差和方差分析，在试验主要研究酶解物抗氧化性的基础上，最终选择O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率為主要参考指标，通过正交试验得到蛋白酶酶解的最优组合为A1B3C1，即底物质量分数2%、酶解时间5 h、加酶量7 000 U/g。

2.3最优组合验证

根据正交试验结果，以DPPH自由基清除能力、还原力、羟基自由基活性、超氧阴离子清除率、抗脂质氧化能力为评价指标，分别对碱性蛋白酶酶解藏鸡蛋卵白蛋白的最优组合进行验证。

在最佳条件下，碱性蛋白酶酶解藏鸡蛋卵白蛋白的酶解多肽O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率、DPPH自由基清除率、·OH清除率分别为71.75%、56.47%、84.46%，还原力、抗脂质过氧化能力分别为0.87、82.83%。此结果可为具体要求下酶解藏鸡蛋卵白蛋白获得酶解多肽提供依据。

3讨论与结论

3.1讨论

单因素试验中，研究底物质量分数对酶解物水解度的影响时发现，酶解过程中酶解产物的水解度并不随着底物质量分数的增加而增加，而是呈先增加、后减小的趋势，这与郭刚军等的研究结果一致，即碱性蛋白酶和中性蛋白酶酶解澳洲坚果粕制备多肽的过程中，水解度与底物浓度之间的现象[20]。这主要由于在酶解过程中，当底物浓度在相对较低的范围内变化时，酶的水解效率受底物浓度的限制，表现为水解度随着底物浓度的增加而逐渐加大；但当底物浓度超出这一范围后，酶解液的黏度随着底物浓度的增加而逐渐变大，蛋白质的溶出率会相应下降，过多的底物分子堆积于酶的活动中心，超过酶饱和时所需的底物浓度，进而影响酶催化速度及产物分子的扩散，从而表现为水解度随着底物浓度的继续升高而下降的现象。

单因素试验中，研究酶解时间对酶解产物抗氧化活性和水解度的影响时发现，酶解过程中随着酶解时间的延长，水解度越来越大，但抗氧化活性却不是越来越强，而是呈先增加、后减小的趋势。产生该现象主要是由于存在过度水解的情况，即在一定的水解时间后，随着水解的继续进行，一些具有抗氧化活性的肽段会被进一步水解，相应的抗氧化活性则消失，整体的抗氧化活性随之下降[21]。可见，并不是水解越彻底则抗氧化活性越强。这也能解释在其他因素的试验结果中，有时也会存在水解度与O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率变化不一致的情况，表明水解度与O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率的变化没有显著相关性，这与李诚等、盛小波、焦宝利等的研究结果[22-24]一致，从另一角度说明多肽的抗氧化活性与肽链中暴露的氨基酸侧链性质、肽的氨基酸序列有关。低水解度时，具有抗氧化活性的氨基酸残基不能暴露，无法显示抗氧化活性；水解度过高时，具有抗氧化活性的肽被进一步水解，抗氧化活性结构被破坏，活性降低[22，25]。

单因素试验中，研究加酶量对酶解物抗氧化活性和水解度的影响时发现，加酶量并不是越多越好，在一定范围内，抗氧化活性与水解度均随着酶添加量的增加而增加，但超过这一范围酶添加量继续增加时，抗氧化活性与水解度反而下降。这可能是由于在一定范围内，随着酶量的增加，底物与酶的接触面积增大，酶解反应速率相应提高，酶解程度越来越大；但当加酶量超过最佳值后，可能由于酶的过量加入造成整个酶解液性质的改变，如造成黏度增加而使酶与底物的结合受到影响等，从而导致水解度和抗氧化活性下降，具体原因有待进一步研究。

3.2结论

以O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率和水解度为指标，通过单因素试验与正交试验，得出碱性蛋白酶酶解藏鸡蛋卵白蛋白的最佳条件为底物质量分数2%、酶解时间5 h、加酶量7 000 U/g。

对最优组合进行验证，在最佳酶解条件下，碱性蛋白酶酶解藏鸡蛋卵白蛋白所得抗氧化肽的O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率、DPPH自由基清除率、·OH清除率分别为71.75%、56.47%、84.46%，还原力、抗脂质过氧化能力分别为0.87、82.83%。该数据为针对性地酶解藏鸡蛋卵白蛋白制备抗氧化多肽提供了依据。

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