柱前衍生化HPLC法测定铁皮石斛破壁饮片中甘露糖的含量

晏薇娜　乔杨　张敏　田民义　王慧娟

摘要：采用柱前衍生化HPLC法测定了12批铁皮石斛破壁饮片中甘露糖的含量。药材采用80%乙醇回流提取除杂后，水煎煮制得石斛多糖，然后将多糖经酸水解为单糖，再用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（ PMP）進行衍生化处理，以盐酸氨基葡萄糖作为内标进样测定。结果平均校正因子为08248，RSD为063%，平均加样回收率为9803%。每批铁皮石斛破壁饮片中单糖含量存在明显差异，但均符合药典要求。

关键词：柱前衍生化；铁皮石斛；甘露糖；HPLC；含量测定

中图分类号：R927 2

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2017）02-0090-05国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.02.020

Abstract：Pre-column derivatization HPLC method was adopted to measure mannose content in 12 batches of Dendrobium. After removing impurity by reflux extraction with 80% ethanol， Dendrobium polysaccharides of the medicinal materials were prepared by water decoction， and then hydrolyzed into monosaccharides which was treated with 1- phenyl -3- methyl -5- （PMP）. Glucosamine hydrochloride was used as the internal standard for sample determination. The results showed that the average correction factor was 08248， RSD was 063%， and the average recovery was 9803%. Although significant differences in the content of monosaccharide in each batch of medicinal materials were observed， they all met the pharmacopoeia requirements..

Key words：pre-column derivatization； dendrobium； mannose； HPLC； determination of content

铁皮石斛药材是兰科植物铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo的干燥茎，具有益味生津，滋阴清热的功效[1]，现代药理学研究表明，铁皮石斛多糖具有增强免疫力、降血糖、降血压、抗氧化、抗肿瘤等药理作用[2-5]，为其主要药效成分。经研究，铁皮石斛多糖主要由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖组成，其中甘露糖的含量最高[6-7]。破壁饮片是采用现代超微技术，将中药饮片粉碎至300目、粒径小于45微米，可供直接口服使用的新型中药饮片。中药破壁饮片具有高效免煎、携带方便、质量可控、安全卫生等特点，因此成为近年中药研究的热点[8]。

本实验采用柱前衍生化HPLC法，测定了贵州某企业提供的12批铁皮石斛破壁饮片中甘露糖的含量。为铁皮石斛破壁饮片的质量控制提供了依据，对石斛多糖的活性研究具有进一步的意义。

1材料与方法

11仪器与试药

111仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪，G1311B输液泵，G1316A柱温箱，G1329B自动进样器，G4212B-DAD检测器，Chemstation色谱工作站。超声仪（KQ-500型，昆山市超声仪器有限公司），循环水式多用真空泵（SHB- IIIS，郑州长城科工贸有限公司），分析天平（METTLER TOLEDO）。

112试剂

乙腈为色谱纯，水为纯净水，甲醇、乙醇、三氯甲烷、PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）、氢氧化钠、盐酸、乙酸铵均为分析纯；葡萄糖对照品（中国食品药品检定研究院提供，供含量测定用，批号：110833-201506，含量999%）；甘露糖对照品（中国食品药品检定研究院提供，供含量测定用，批号：140651-201403，含量996%）；盐酸氨基葡萄糖对照品（中国食品药品检定研究院提供，供含量测定用，批号：140649-201505，含量99%）。

12实验方法

121色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（46mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈-002mol/L的乙酸铵溶液（19∶81）；检测波长：250nm；流速：07mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL。

122对照品溶液和内标溶液的制备内标溶液：取盐酸氨基葡萄糖适量，精密称定，加水制成每1mL含1204mg的溶液，即得。

内标稀释液（10倍）：精密量取内标溶液10mL，置10mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

内标稀释液（100倍）：精密量取内标溶液10mL，置100mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

甘露糖对照品贮备液：精密称定甘露糖对照品5040mg，置50mL量瓶中，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

甘露糖对照品溶液：精密量取甘露糖对照品贮备液10mL，置10mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

加内标的甘露糖对照品溶液：精密称定甘露糖对照品1015mg，置100mL量瓶中，精密加入内标溶液1mL，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

123多糖的水解

取铁皮石斛破壁飲片约012g，置索氏提取器中，加80%乙醇适量，加热回流提取4小时，弃去乙醇液，药渣挥干乙醇，滤纸筒拆开置于烧杯中，加水100mL，再精密加入内标溶液2mL，煎煮1小时并时时搅拌，放冷，加水补至约100mL，混匀，离心，吸取上清液1mL，置顶空瓶中，加30mol/L的盐酸溶液05mL，封口，混匀，110℃水解l小时，放冷，用30mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至中性，备用。

124衍生化产物的制备

取对照品溶液、内标溶液和供试品溶液400μL，加05mol/L的PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮）甲醇溶液与03mol/L的氢氧化钠溶液各400μL，混匀，70℃水浴反应100分钟。再加03mol/L的盐酸溶液500μL，混匀，用三氯甲烷洗涤3次，每次2mL，弃去三氯甲烷液，水层离心后，取上清液10μL，注入液相色谱仪，测定。

2 结果与分析

21系统适用性试验

分别吸取空白溶液、内标稀释液（100倍）、甘露糖对照品溶液、加内标的甘露糖对照品溶液、加内标的供试品溶液的衍生产物进样测定，供试品溶液和对照品溶液中甘露糖、氨基葡萄糖的保留时间一致，理论板数按甘露糖峰计算大于4000。供试品溶液中甘露糖、氨基葡萄糖与其相近的峰分离度大于15，结果如图1。

22线性关系的考察

精密量取甘露糖对照品贮备液02mL、04mL、06mL、08mL、10mL、12mL、20mL、40mL，分别置l0mL量瓶中，精密加入内标稀释液（10倍）10mL，加水稀释至刻度，摇匀，吸取400μL，衍生化处理后进样10μL测定，记录色谱图。以浓度比C对照品/C内标为横坐标（X），相应的峰面积比A对照品/A内标为纵坐标（Y）（见图2），计算回归方程为：y = 1257x - 00303（R2 = 09996）。

23精密度试验

精密量取甘露糖对照品贮备液08mL、10mL、12mL，分别置10mL量瓶中，精密加入内标稀释液（10倍）10mL，加水稀释至刻度，摇匀，吸取400μL，衍生化处理后进样测定，记录色谱图，按式（1）计算校正因子f，结果见表1。平均校正因子为08248，RSD为063%。

校正因子（f）=A内标/C内标A对照品/C对照品（1）

24重复性试验

取第一批铁皮石斛破壁饮片，按“123”项下方法处理，平行制备6份供试品，再衍生化后分别进样10μL，结果甘露糖的平均含量为1568mg/g，RSD为263%（见表2），表明方法重复性良好。

25稳定性试验

取供试品溶液，分别于衍生化后0、4、8、12、24h进样测定，结果甘露糖衍生物峰面积在24h内基本无变化，RSD为112%（见表3），说明供试液衍生化后在24h内稳定性良好。

26加样回收率试验

精密称取第一批铁皮石斛破壁饮片6份，每份约006g，置索氏提取器中，加80%乙醇适量，加热回流提取4h，弃去乙醇液，药渣挥干乙醇，滤纸筒拆开置于烧杯中，加水100mL，再精密加入内标溶液2mL和甘露糖对照品约90mg，煎煮1h并时时搅拌，放冷，加水补至约100mL，混匀，离心，吸取上清液1mL，置顶空瓶中，加30mol/L的盐酸溶液05mL，封口，混匀，110℃水解1h，放冷，用30mol/L的氢氧化钠溶液调节pH值至中性，吸取400μL，衍生化处理后进样测定，计算回收率，结果如表4。

27样品测定

取12批铁皮石斛破壁饮片约012g，按“123”和“124”项下方法处理，每批饮片平行制备3份供试品溶液，然后进样10μL进行测定，计算甘露糖含量、甘露糖和葡萄糖峰面积比，结果见表5。

3讨论

多糖是铁皮石斛的主要有效成分，其主要由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖组成[9]，其中含量最多的是甘露糖，因此在多糖研究基础上，利用甘露糖作为含测指标，更能全面客观的评价出铁皮石斛的质量。本实验结果甘露糖含量范围为1602%～2781%，可能是由于12批成破壁饮片在粉碎后粒度差异的原因，显示出每批饮看的质量良莠不齐，且不具规律性，但均符合药典标准。

由于单糖在紫外区没有吸收，因此不能用常规的紫外检测器来检测。根据文献，常用的检测单糖的主要方法有HPLC-RID法、柱前衍生化高效液相色谱法、HPLC-ELSD法等[10]。HPLC-RID法选择性较差，对流动相、柱温等太敏感，而HPLC-ELSD法的研究还较少，不够成熟。本实验采用柱前衍生化HPLC法，以盐酸氨基葡萄糖作为内标，以DAD为检测器，测定了铁皮石斛破壁饮片中甘露糖的含量。结果表明该方法能够快速、灵敏、准确地测定出单糖。

参考文献：

[1]国家药典委员会. 中华人民共和国药典一部[M].北京人民卫生出版社，2015.

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[3]屠国昌. 铁皮石斛的化学成分、药理作用和临床应用[J]. 海峡药学，2010，22（2）：70-71.

[4]刘亚娟. 铁皮石斛多糖对小鼠胚胎干细胞生长的影响及抗癌免疫活性研究[D]. 浙江：浙江工业大学，2014.：54-58.

[5]张贝贝，刘文洪，李俊峰，等. 铁皮石斛多糖对高糖诱导的血管内皮细胞 Bax、Bcl-2 表达的影响[J]. 中国药理学通报，2015，31（10）：64-70.

[6]谭丹，杨传玉，胡珺，等. 贵州不同产地铁皮石斛的单糖组成[J]. 贵州农业科学，2016，44（9）：105-108.

[7]宾宇波，王亚芸，安欣，等. 铁皮石斛多糖分离纯化及单糖组成测定[J]. 食品工业科技，2014，35（4）：122-125.

[8]成金乐，赖智填，彭丽华. 中药破壁饮片研究[J]. 世界科学技术-中医药现代化，2014，16（2）：254-262.

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[10]谭和平，叶善蓉，陈丽，等.茶叶中糖类物质分析方法综述[J]. 中国测试技术，2007，3（5）：1-4.