异丙甲草胺对烤烟根际土壤微生物和酶活性的影响

谢颖　陈媞　龙友华　李荣玉　尹显慧　李明　吴小毛

摘要：为了探明根际微生物数量与除草剂污染之间的关系，研究了异丙甲草胺对烟草植地根际与非根际土壤微生物的种群动态变化、土壤呼吸强度及酶活性的影响。结果表明：根际土壤中微生物数量、土壤呼吸强度和酶活性均高于非根际土壤。根际土壤微生物对异丙甲草胺的敏感程度依次为真菌〉细菌〉放线菌；除过氧化氢酶外，根际土壤脱氢酶、脲酶及磷酸酶的活性与对照土壤均存在显著差异。第60 d，异丙甲草胺在根际土壤中的降解率为8050%，半衰期为2682d，比在非根际土壤中的降解速率提高了121倍，半衰期缩短了1776%。

关键词：异丙甲草胺；根际；土壤微生物；呼吸强度；酶活性

中图分类号：S4828+92

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2017）02-0013-06国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.02.003

Abstract：In order to investigate the relationship between the herbicide contamination and the number of microorganisms in plant rhizosphere soil， the effect of metolachlor on the microbial number， the intensity of soil respiration and the enzyme activity in tobacco rhizosphere and non-rhizosphere soils were studied. The results showed that the number of rhizosphere microorganisms， the soil respiration intensity and the enzyme activity were higher in rhizosphere soil than non-rhizosphere soil. The sensitivity of microorganisms to metolachlor in rhizosphere soil was in the order of fungi > bacteria> actinomycetes. Except for catalase， there were significant differences between activities of dehydrogenase， urease and phosphatase in the rhizosphere soil and in the non-rhizosphere soil. At 60th day， the degradation rate of metolachlor was 8050% and its half-life was 2682 day in rhizosphere soil. The degradation rates of metolachlor in rhizosphere soil were 121 times of that in non-rhizosphere soil. The degradation half-life of metolachlor in the rhizosphere soil was 1776% shorter than that in the non-rhizosphere soil.

Key words：metolachlor； rhizosphere； soil microorganism； respiration rate； enzymatic activit

根际环境与根际微生物是植物降解有毒有害有机污染物的基础，农药等有机污染物影响下的根际土壤与一般土壤在pH、养分组成状况、微生物组成、酶活性等存在显著的差别，這些都直接影响一年生单子叶及部分双子叶杂草的防除时施用的接影响有机污染物在土壤-植物系统中的迁移和转化行为[1]。

异丙甲草胺作为持效期较长的酰胺类选择性芽前除草剂，广泛使用烟草、水稻、大豆田中一年生单子叶及部分双子叶杂草的防除[2]。目前，已有异丙甲草胺的研究主要有异丙甲草胺对根际土壤微生物数量的影响及其在根际环境中的降解研究、异丙甲草胺对芹菜根际与非根际生物活性的影响、异丙甲草胺及其高效体对我国南方潮土微生物的影响、异丙甲草胺防除烟地杂草效果评价等，但未见异丙甲草胺对烟地根际微生物及土壤酶活性的影响的相关报道[3-6]。为此从异丙甲草胺对土壤微生物种群动态变化及土壤呼吸作用，土壤根际与非根际酶活性以及其残留等方面探讨异丙甲草胺对土壤环境质量的影响提供科学依据。

1材料与方法

11供试药品

异丙甲草胺标准品（≥988%）购自美国迪马科技有限公司；72%异丙甲草胺乳油购自江西日上化工有限公司；乙腈（色谱纯）；纯净水（用前过045μm水系滤膜过滤）购自杭州娃哈哈集团。试验中其他药品和试剂均为分析纯。

12供试土壤

土壤采自贵州花溪烤烟种植试验地中，以烤烟K326烟株为中心15cm半径范围铲出整个土块，抖落大块土壤后的烟株根系连同与之紧密黏附的土壤置于保鲜袋带回实验室，仔细刷下并收集黏附于烟株根系的土壤，风干，过1mm筛，作为烟株根际土壤。

13试验方法

分别称取500g花溪植烟土壤于1000mL 烧杯中，加入1mL含异丙甲草胺的甲醇溶液，使其浓度分别为1、3、6、9、12mg/kg，待甲醇挥发后搅拌均匀，用无菌蒸馏水调节土壤湿度为田间最大持水量的60%，每个处理均设置3次重复，同时设空白对照。土样于25℃培养箱中恒温黑暗培养1、3、7、14、21、30、45和60d后取样测定真菌、细菌和放线菌数量、过氧化氢酶、脱氢酶、脲酶和磷酸酶的活性、土壤呼吸强度，及异丙甲草胺残留量。在整个试验阶段，适时补水保持土壤含水量不变。

14分析方法

土壤微生物计数采用固体平板梯度稀释涂布培养计数法，细菌用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基培养，放线菌用改良高氏1号培养基培养，真菌用查彼克氏培养基培养；土壤呼吸强度采用直接吸收法（密闭法）滴定测定[7]；过氧化氢酶活性采用高锰酸钾滴定法测定；脲酶活性采用靛酚蓝比色法测定；由于供试土壤pH为632，故按中性磷酸酶测定方法测定土壤磷酸酶活性；脱氢酶采用三苯基四氮唑氯化物（TTC）比色法测定[8]。以上试验均采用室内模拟方法，设4个对照，每个对照设3次重复，其中1个处理设为空白对照，取三次重复的平均值。

2结果与分析

21异丙甲草胺影响下根际土壤微生物区系的动态变化

异丙甲草胺影响下根际土壤细菌数量的变化如图1所示。由图可知，在整个试验期内，根际土细菌数量均高于非根际土；经异丙甲草胺处理根际与非根际土壤，细菌的生长开始被抑制，然后被促进。在试验前期（1～7d），与对照土壤相比，施用异丙甲草胺处理后，根际与非根际土壤细菌的生长均受到抑制，在第1d时抑制作用达到最大值。随后，各处理的抑制作用逐渐减弱，异丙甲草胺在第14d时对根际土壤细菌生长的抑制效应消失，开始促进细菌生长，且促进效应一直继续到试验结束，并且细菌数量均显著高于对照土壤（p<005）。经异丙甲草胺处理根际土壤的细菌数量在21d到达最大值，其中处理根际土壤细菌数量比对照根际土壤的增加了2407%，而非根际土壤细菌数量比对照土壤的降低了993%。此时，处理根际土壤细菌数量是处理非根际土壤的109倍，即处理土壤的根际效应R/S（每克根际土壤中所含的微生物数与非根际土壤的相应值之比）为101，而对照土壤的根际效应R/S为106，差异均达到显著水平（p<005）。

从图2可以看出，异丙甲草胺对根际与非根际土壤真菌的生长一直表现为促进作用，30～60d内，真菌数量均显著高于对照土壤。异丙甲草胺处理土壤真菌数量在14d时均到达最大值，其中根际土壤真菌数量比对照土壤增加了3098%，相应的非根际土壤真菌数量比对照土壤增加了2600%，此时处理土壤的根际效应R/S也达到峰值为112，对照土壤的根际效应R/S为108，差异达到显著水平（p<005）。在整个试验周期内，无论是处理土壤还是对照土壤，根际土中的真菌数量均要高于非根际土，但在试验后期（45～60d），根际与非根际土壤的真菌数量之间不存在显著差异。

异丙甲草胺毒害下根际土壤放线菌数量的变化见图3。在培养期间，根际土壤放线菌数量均高于非根际土壤；异丙甲草胺对放线菌生长的影响为抑制-恢复-刺激。处理后1～14d，与对照土壤相比，异丙甲草胺处理下的放线菌生长受到抑制，1d时抑制作用最大，根际土壤的最大抑制率为1460%，非根际土壤的抑制率为1441%。异丙甲草胺处理土壤根际土壤的放线菌数量在14d时达到峰值，此时，处理土壤的根际效应R/S也达到最大值为107，差异也达显著水平（p<005）。14d后抑制作用逐渐减弱，异丙甲草胺处理的根际土壤放线菌数量在21d时恢复到对照水平，30d时开始促进放线菌生长，且促进作用一直继续到试验结束，但差异不显著。在整个试验周期内，无论是处理土壤还是对照土壤，根际土中的放线菌数量均要高于非根际土。

22异丙甲草胺影响下根际土壤呼吸的动态变化

异丙甲草胺对根际土壤呼吸的影响如图4所示。由此可知，与非根际土相似，施用异丙甲草胺对根际土壤呼吸均有一定的刺激作用，在3d时，土壤呼吸强度达到了最高值，异丙甲草胺处理的根际土壤呼吸强度比对照土壤和对照非根际土增加了1994%，相应的非根际土壤呼吸强度比对照土壤的增加了1589%，处理根际比处理非根际土增加了1595%，即处理土壤的根际效应R/S为116，对照土壤的根际效应R/S为112，差异均达到显著水平（p<005）。随后异丙甲草胺对根际土壤呼吸的刺激作用逐渐减弱。经异丙甲草胺处理根际土壤的呼吸在7～60d内继续保持刺激状态，而非根際土壤的呼吸强度在45d时基本与对照持平。在整个试验周期内，根际土壤呼吸强度均高于非根际土壤。

23异丙甲草胺影响下根际土壤酶活性的动态响应

施用异丙甲草胺后，根际与非根际土壤过氧化氢酶活性的响应如图5所示。在整个试验期内，各处理根际土壤的过氧化氢酶活性均高于对照土壤；异丙甲草胺处理根际土壤的过氧化氢酶活性呈现激活-恢复的变化趋势。在试验前期（1～14d），各处理对土壤过氧化氢酶活性均有一定的激活作用，激活作用均在1d时最为强烈，异丙甲草胺处理后，根际土壤过氧化氢酶活性比对照土增加了3024%，相应的非根际土壤酶活性仅增加2064%，处理土壤的根际效应R/S为115，而对照土壤的根际效应R/S为105。显著性分析表明，各处理的激活作用逐渐减弱，至第21d时，激活效应消失，均表现为抑制作用，异丙甲草胺处理非根际土壤的酶活性在21d时也显著低于对照土壤，30d左右异丙甲草胺对根际与非根际土壤酶活性的抑制作用消失，过氧化氢酶受到第二次激活，且激活效应一直继续到试验结束，但酶活性与对照土壤不存在显著差异（p<005）。

图6可以看出，在试验的各个时期，无论是对照土样，还是处理土样，根际土的脱氢酶活性均比同期的非根际土壤酶活性要高。与非根际土相似，在整个培养期间，经异丙甲草胺处理后，根际土壤脱氢酶活性的变化为激活-抑制-恢复-激活。在试验初期（1～3d），除草剂对土壤脱氢酶活性均有一定的激活作用，激活作用和根际效应在3d时达到峰值，施用异丙甲草胺的根际土壤脱氢酶活性为对照土壤的10973%，相应的非根际土壤酶活性为对照土壤的10437%，处理土壤和对照土壤的根际效应R/S为113，差异均达显著水平（p<005）。3d后，各处理对脱氢酶的刺激作用逐渐降低，异丙甲草胺处理根际与非根际土壤的酶活性均在7d时恢复至对照水平，在14d时被显著抑制（p<005），30d时酶活性恢复至正常水平，45d时脱氢酶受到第二次激活，且酶活性显著高于对照土壤，并一直继续至试验结束。

异丙甲草胺对根际与非根际土壤脲酶活性的影响见图7。经异丙甲草胺处理后，根际土壤脲酶活性的变化如图7所示，与非根際土壤相似，在整个试验期间，异丙甲草胺对土壤脲酶活性的影响呈现先抑制、后恢复、再激活的变化动态。异丙甲草胺对根际土壤脲酶活性的抑制作用在7d时达到最大值，处理根际土壤脲酶活性比对照土壤降低了684%，相应的处理非根际土壤酶活性比对照土壤的降低了651%，此时异丙甲草胺处理土壤根际效应R/S也达到峰值为109，且相应对照的根际效应与R/S为108，均存在显著差异（p<005）。7d后异丙甲草胺对土壤酶活性的抑制作用逐渐降低，21d时均恢复至对照水平，并在45d时高于对照土壤。在整个试验期内，无论是处理土壤还是对照土壤，根际土样脲酶活性均要高于非根际土样。

异丙甲草胺影响下根际土壤磷酸酶活性的变化见图8。从图可以看出，培养期间，根际土磷酸酶活性均高于同期的非根际土。在试验前期（1～21d），与非根际土壤相似，除草剂处理下的根际土壤磷酸酶均受到抑制，7d时，抑制效应达到峰值，异丙甲草胺处理根际土壤的磷酸酶活性为对照土壤的8477%，相应的非根际土壤酶活性为对照土壤的8362%，而处理根际土壤酶活性为处理非根际土壤的11284%，即处理土壤的根际效应R/S为113，而对照土壤的根际效应R/S为111，存在显著差异（p<005）。14d后异丙甲草胺对根际土壤磷酸酶的抑制作用逐渐减弱，在30d时恢复至对照水平，异丙甲草胺处理土壤的酶活性于45d后高于对照土壤，60d时差异均达显著水平（p<005）。

24异丙甲草胺在根际土壤中的降解动态

异丙甲草胺在根际土壤与非根际土壤中的降解动态如图9所示。试验初期（1～3d），异丙甲草胺在土壤中的降解不明显，有一个延迟期，可能是因为土壤中微生物对外来污染物有一个驯化或适应过程。第7d开始，异丙甲草胺降解速度加快，尤其是在根际土壤中，在第60d，根际土壤中异丙甲草胺的降解率为8050%，而在非根际土壤中的降解率仅为7383%，差异均达到显著水平（p<005）。异丙甲草胺在根际土壤中的降解也可用一级反应动力学方程模拟（表1），根际土壤中异丙甲草胺的降解速率常数为00259，相应的半衰期为2682d；非根际土壤中异丙甲草胺的降解速率常数为00213，其半衰期为325d。与非根际土壤相比，根际土壤中异丙甲草胺的降解速率提高了121倍，半衰期缩短了1776%。

3结论

（1）在整个试验周期内，异丙甲草胺影响下根际土壤中三大类群微生物的数量均高于非根际土壤微生物，这与异丙甲草胺对根际土壤微生物数量的影响及其在根际环境中的降解研究结果相符。真菌对异丙甲草胺最为敏感，细菌次之，放线菌则具有一定的抗性。培养期间，经处理后的土壤的细菌和放线菌的生长呈现出抑制、恢复或激活的变化动态。

（2）施用异丙甲草胺对根际土壤呼吸均有一定的刺激作用，在3d时，土壤呼吸强度达到了最高值，随后异丙甲草胺对根际土壤呼吸的刺激作用逐渐减弱，在随后的7～60d继续保持刺激状态，而非根际土壤的呼吸强度在45d时基本与对照持平。在整个试验周期内，根际土壤呼吸强度均高于非根际土壤。这与异丙甲草胺及其高效体对潮土微生物的影响结果相近[9]。

（3）本研究表明，无论是处理土壤还是对照土壤，根际土样中四种酶的活性均要高于非根际土壤。异丙甲草胺对土壤过氧化氢酶和磷酸酶活性的影响表现为激活-抑制-恢复的变化动态，且对过氧化氢酶激活或抑制程度与浓度成正比。对脱氢酶活性的影响呈现为激活-抑制-恢复-激活，这与试验发现68mg/kg和68mg/kg的Rac-异丙甲草胺及S-异丙甲草胺对脱氢酶活性的影响为先激活、后抑制、再激活的研究结果相近[10]；土壤脲酶活性变化则呈现“抑制-激活-恢复-抑制”趋势，这与丁草胺对脲酶活性的影响大致相符[11]。

（4）研究表明，从第7 d开始，异丙甲草胺降解速度在根际土壤中高于非根际土壤中，第60d，根际土壤中异丙甲草胺的降解率为8050%，而在非根际土壤中的降解率仅为7383%，差异均达到显著水平（p<005）。根际有机污染物消解加快与根际区微生物数量及活性改变关系密切[12-14]。

参考文献：

[1]贺永华根际土壤中甲磺隆除草剂快速降解及其生态化学机制[D]杭州：浙江大学，2006

[2]郭华，朱红梅，杨红 除草剂草萘胺在土壤中的降解与吸附行为[J]环境科学，2008（29）：1729-1736

[3]周瑛，刘维屏，王婷婷异丙甲草胺及其高效体对我国南方潮土微生物的影响Ⅰ过氧化氢酶[J] 应用生态学报， 2005（5）：895-898

[4]陈波，徐冬梅，吴军林异丙甲草胺对根际土壤微生物数量的影响及其在根际环境中的降解研究[J]农业环境科学学报，2006，25（4）：898-902

[5]陈波，徐冬梅，刘广深异丙甲草胺对芹菜根际与非根际生物活性的影响[J]应用生态学报，2006，17（5）：925-928

[6]周艳华，余清 6种除草剂防除烟地杂草效果评价[J] 农药，2006（1）：49-51

[7]关松荫土壤酶及其研究法[M]北京：农业出版社，1986

[8]郑洪元，张德生土壤动态生物化学研究法[M]北京：科学出版社，1982：173-252

[9]周瑛，刘维屏，叶惠娜 异丙甲草胺及其高效体对潮土微生物的影响Ⅱ土壤呼吸[J]应用生态学报，2006，17 （7）： 1305-1309

[10]刘惠君，田宝莲，熊明瑜，等Rac-异丙甲草胺及S-异丙甲草胺与镉复合污染对土壤酶活性的影响[J]土壤学报，2009，46（1）：122-126

[11]单敏，虞云龙，方华丁草胺对土壤微生物数量和酶活性的影响[J]农药学学报，2005，7（4）：383-386

[12]Arthur，EL，Perkovich，BS， Anderson，TAet alDegradation of an atrazine and metolachlor herbicide mixture in pesticide contaminated soils from two agrochemical dealerships in Iowa [J]Water Air & Soil Pollution，2000（119）：75-90

[13]Sun HW，Xu J，YangSH，et alPlant uptake of aldicarb from contaminated soil and its enhanced degradation in the rhizosphere [J]Chemosphere，2004（54）：569-574

[14]彭振宝，赵思峰，危常州，等甲拌磷残留对加工番茄根际与非根际微生物活性的影响[J]石河子大学学报，2010，28（3）：303-309