威宁绵羊IGF—1基因外显子多态性分析

刘标　易鸣　张依裕　王振　程朝友　杨德文　程均华　付正仙　王进

摘要：为了更好地保护和开发利用威宁绵羊这一优良地方品种，本实验利用威宁绵羊构建DNA池，设计4对引物扩增威宁绵羊IGF-1基因外显子及部分内含子序列。将PCR产物纯化并进行双向测序，通过DNAStar生物软件分析确定多态性位点。利用在线生物信息学软件分析多态位点对IGF-1基因RNA的二级结构、类胰岛素生长因子1的二级和三级结构的影响。结果表明，在扩增的IGF-1基因中筛选到3个SNPs：Intron1-A4387C、Exon2-T87C、Exon4-A27T，其中Exon4-A27T为错义突变，导致编码的精氨酸（Arg）变为丝氨酸（Ser）；Exon2-T87C多态位点均未改变氨基酸的编码，为同义突变；Intron1-A4387C在內含子区，不参与氨基酸编码。

关键词：威宁绵羊；IGF-1基因；SNPs

中图分类号：Q812

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2017）02-00082-04国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.02.018

Abstract：In order to protect and utilize the fine local variety， DNA pool of Weining sheep was constructed. 4 primers were designed to amplify exon and intron sequences of IGF-1 gene in Weining sheep . Products of PCR were purified and bidirectional sequenced to determine the SNPs. Influence of polymorphic sites on the RNA secondary and tertiary structure of IGF-1 gene was analyzed by online bioinformatics software. The result showed that 3 SNPs were detected in IGF-1 gene， namely Exon2-T87C， a synonymous mutation； Exon4-A27T， a missense mutation which changed the code of Arg into Ser； and Intron1-A4387C， a noncoding mutation in the intron.

Key words：Weining sheep； IGF-1 gene； SNPs

威宁绵羊的主产区为贵州省威宁县，有悠久的饲养历史，属藏系山谷型粗毛绵羊。威宁绵羊体质结实，个体矮小，生长速度慢，繁殖能力差，生产性能低下。因此，对威宁绵羊的育种工作，特别是分子辅助育种对威宁绵羊的保护和开发利用具有重要意义。

类胰岛素生长因子（IGF）与胰岛素原相似，是一种单链多肽，包括IGF-1和IGF-2。IGF-1能够促进动物的生长，并且对胎儿的生长也有一定的作用，Breier B H等[1]研究发现，IGF-1基因缺失会使小鼠初生重下降。前人研究发现人类IGF-1基因5′调控区多态性与高度近视、身高肥胖和疾病的发生具有显著相关性[2-4]。王明辉[5]通过研究IGF1-FoxO通路发现基因间的互作效应会对猪的生长性状产生影响。张春香[6]通过对山羊IGF-1基因的多态性研究发现该基因的多态性显著影响山羊的初生重和周岁体重。孙伟[7]以不同发育时期的湖羊为研究对象，采用荧光定量PCR技术对湖羊背最长肌中IGF-1基因的表达变化进行探究，结果发现IGF-1基因和湖羊背最长肌肌纤维的密度之间呈显著负相关。

本实验构建威宁绵羊DNA池[8] （Sham P， 2002），筛选类胰岛素生长因子1基因的SNP位点，并对多态位点作生物信息学分析，利用软件估算等位基因频率，研究SNP位点对类胰岛素生长因子1基因的mRNA二级结构和类胰岛素生长因子结构的影响，为后续实验研究类胰岛素生长因子1对威宁绵羊生长发育和生产性能的影响提供一定的参考。

1材料与方法

11实验材料

实验用到的动物是贵州省毕节市威宁县绵羊，共采取了80只威宁绵羊血样，采样后低温保存备用。

12DNA池的构建

本实验提取威宁绵羊血样DNA所用的材料是生物公司提供的Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒，下一步进行电泳用自己配制的1%琼脂糖凝胶，目的是检验DNA的提取是否达到预估的效果。在完成DNA的提取及电泳后，接下来测定所提取的DNA的浓度，用光度计仪（核心原理是：超微量紫外分光）对所提取的DNA进行检测，检查完浓度后将其浓度稀释到100ng/μL备用，取3μL混合均匀的威宁绵羊DNA样品构建DNA池。

13目的片段的扩增

在NCBI数据库中查询到GenBank登录号：NC_0194601为绵羊类胰岛素生长因子1基因的DNA序列，引物的设计是利用生物软件Primer 50做出了4对特异性引物，并送到生物公司进行合成，引物信息见表1。PCR反应体系为30μL：15μL 2×Es Taq Master Mix （含染料），3 μL模板DNA （Template DNA），72μL双蒸水，上、下游引物各为24μL。进行PCR反应所用仪器是TC-512 PCR仪，PCR扩增条件：95摄氏度预变性5min；95摄氏度变性30s，分别在各对特异性引物对应的最适温度（627℃），30μLs的时间退火，72摄氏度延伸一分钟，循环次数为35，结束后循环温度不变终止延伸5分钟，4摄氏度温度保存备用。

14序列分析

PCR产物送到立菲生物技术有限公司进行测序，比对测序结果、分析确定多态位点使用DNAstar软件。

15测序图峰高测量及等位基因频率估算

多态位点等位基因估算公式：Pi=Hi/（H1+H2）

式中i=1、2，Pi代表多态位点的各等位基因频率，H1和H2分别代表测序峰图上此多态位点各等位基因对应的峰的高度。

16IGF-1基因的RNA二级结构预测及蛋白结构分析

RNA的二级结构：http：//rnatbiunivieacat/cgi-bin/RNAfoldcgi

蛋白质二级结构：https：//npsa-prabiibcpfr/cgi-bin/npsa_automatpl？page=npsa_sopmahtml

蛋白質三级结构：http：//wwwsbgbioicacuk/phyre2/html/pagecgi？id=index

2结果与分析

21DNA池的PCR产物测序

将由4对引物特异性扩增出威宁绵羊IGF-1基因的目的序列送立菲生物技术有限公司经胶回收纯化后双向测序，测序结果与绵羊IGF-1基因DNA序列（GenBank登录号：NC_0194601）对比，确定为绵羊IGF-1基因序列。利用生物软件分析共发现3个多态位点，以类胰岛素生长因子1基因每一个外显子第1位碱基计数为1，多态位点分别为：Intron1-A4387C、Exon2-T87C、Exon4-A27T，见图1。这些SNPs是否在不同绵羊品种中普遍存在，需要进一步研究。SNPs能否造成威宁绵羊生长性能变化也需后续实验进行研究。

22SNPs等位基因频率估算

对威宁绵羊IGF-1基因三个多态位点的等位基因峰高用生物软件进行测量，各等位基因多态位点频率应用公式进行估算，所得估算结果呈现在表2中。由此可看出，不同SNP位点等位基因频率有较大的差异。

23突变前后IGF-1的RNA二级结构分析

对突变前后IGF-1基因RNA二级结构利用在线软件进行了检测，分析和整理检测结果，其中显示为：所检测的多态位点并没有使RNA的二级结构有显著的变化情况。但导致RNA二级结构最小自由能减小的是突变位点，结果中-64580 kcal/mol是由-64490kcal/mol所变。影响其结构的稳定性可能是自由能的改变所致，因而改变后来蛋白质的翻译过程以及其相关功能的表达，由图2可知。

24突变前后蛋白质二级结构分析

采用在线软件预测威宁绵羊IGF-1基因突变前后蛋白质二级结构变化。结果显示：突变前后蛋白质的二级结构未发生变化。

24突变前后蛋白质三级结构分析

利用在线预测软件对威宁绵羊类胰岛素生长因子1突变前后的三级结构进预测分析，结果表明多态位点未导致威宁绵羊的类胰岛素生长因子1三级结构发生显著改变（图3）。

3讨论

类胰岛素生长因子1分子结构与胰岛素分子类似，生物学功能和胰岛素相似。Wang[9]以中国西南地区的十几个山羊品种为试验动物进行研究，研究结果显示古兰马羊 IGF-1基因微5′侧翼区的多态和产羔数显著相关，对初生重的影响未达到显著水平。曹海洋[10]通过对IGF-1基因与小尾寒羊体尺、产羔数及血液理化性质等性状的关联分析研究发现，IGF-1基因和这些性状有显著关联效应，认为IGF-1基因能够作为小尾寒羊生产性状的分子标记。因此，对威宁绵羊类胰岛素生长因子1基因的研究有望改变威宁绵羊生产性能差，绵羊个体之间差距大的情况，对威宁绵羊种质资源的保护和育种提供帮助。

本次研究在威宁绵羊IGF-1基因中检测得到3个多态性位点： Intron1-A4387C、Exon2-T87C、Exon4-A27T，其中Exon4-A27T为错义突变，导致编码的精氨酸（Arg）变为丝氨酸（Ser）；Exon2-T87C多态位点均未改变氨基酸的编码，为同义突变；Intron1-A4387C在内含子区，不参与氨基酸编码。通过对四个SNP位点的等位基因频率的比较发现，不同SNP位点等位基因频率有较大的差异。Exon2-T87C、Exon4-A27T位点导致IGF-1基因RNA二级结构自由能发生变化，可能影响RNA结构的稳定性，从而影响蛋白质的翻译过程，错义突变位点Exon4-A27T未导致蛋白质二级结构和三级结构发生明显改变。

参考文献：

[1]Breier B H， Gluckman P D， Bass J J Plasma concentrations of insulin-like growth factor-I and insulin in the infant calf： ontogeny and influence of altered nutrition[J] Journal of endocrinology， 1988， 119（1）： 43-50

[2]庄文娟 中国人群 IGF-1 基因多态性与高度近视的相关性研究[J] 重庆： 重庆医科大学， 2012

[3]杨锐睿 重庆市中学生身高， 肥胖相关基因多态性与生长发育的关系研究 [D] 北京： 北京体育大学， 2012

[4]胡贵川，冯将，鲜思美，等贵州黑山羊IL-2基因的克隆及序列分析[J]山地农业生物学报，2016（5）：25-29

[5]王明辉 候选基因集法及 IGF1-FoxO 通路与猪生长发育的关联研究[D] 上海：上海交通大学， 2011

[6]张春香， 罗海玲， 陈喻， 等 IGF-1 基因内含子 4 多态性与南江黄羊生长性状的关系[J] 中国草食动物， 2008， 28（5）： 14-16

[7]孙伟， 李达， 马月辉， 等 湖羊GHR和IGF-1基因表达的发育性变化及其与肉质性状的关联[J] 中国农业科学， 2012， 45（22）： 4678-4687

[8]Sham P， Bader JS， Craig I， et al， DNA pooling： a tool for large-scale association studies[J] Nature Reviews Genetics， 2002，3（11）： 862-871

[9]WANG P， Ying T A N， ZHANG B， et al DNA Polymorphisms of 5′-Flanking Region of Insulin-Like Growth Factor 1 Gene and Their Association with Reproduction Traits in Goats[J] Agricultural Sciences in China， 2011， 10（10）： 1609-1617

[10]曹海洋 小尾寒羊ADPN和IGF1基因多态性及其遗传效应分析[D] 泰安：山东农业大学， 2013