贵州白山羊L—FABP基因遗传变异对生长性状的影响

田应志　崔真华　牟慧蓉　钱成　黄兰　封竣淇　罗卫星

摘要：本研究旨在探讨肝脏型脂肪酸结合蛋白（L-FABP）基因遗传变异与贵州白山羊生长性状的关联性，以期得到能够影响贵州白山羊各群体生长性状显著效应的分子遗传标记。试验采用DNA池、PCR-SSCP法结合PCR产物直接测序对贵州白山羊L-FABP 基因4个外显子进行SNPs筛选，并利用SPSS 180统计软件分析H-FABP基因遗传变异与生长性状间的相关性。多态位点检测表明，贵州白山羊L-FABP基因内含子两处存在C4557T和A4575G两个多态基因座；遗传效应分析表明，L-FABP基因C4557T和A4575G位点多态座位有利于提高贵州白山羊体重、体高、体斜长和管围，其中基因型CCGG有利于提高贵州白山羊成年母羊的体高和体斜长；TTGG有利于提高贵州白山羊周岁母羊的体重和管围。研究结果初步推测L-FABP基因可能影响贵州白山羊部分生长性状的主效基因或与主效基因连锁，其多态座位可能作为山羊生长性状选择的有效遗传标记。

关键词：贵州白山羊；L-FABP基因；遗传变异；生长性状

中图分类号：Q751；S827

文献标识码：A

文章编号：1008-0457（2017）02-0006-07国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.02.002

Abstract：The aim of this study was to explore the correlation between the genetic variation of L-FABP gene and the growth traits of Guizhou white goat in order to obtain molecular genetic markers that could affect the goats growth traits. The SNPs of four different exons of L-FABP genes of Guizhou white goat were screened by DNA pooling and PCR-SSCP combined with PCR product direct sequencing. The correlation between the genetic variation of L-FABP gene and the growth traits was analyzed by SPSS （18.0） software. Examination of the polymorphism loci showed that two SNPs （C4557T and A4575G） were presented in the Intron 2 of L-FABP gene. The effect analysis showed that the polymorphic loci of C4557T and A4575G sites of L-FABP gene can improve body weight， body height， body length and pipe circumference. The genotype CCGG can be in favour of improving body height and body length of adult ewes. The genotype TTGG can be in favour of improving body weight and pipe circumference in aging ewes. The results indicated that L-FABP gene would be a potential major gene or a gene linked to other major genes affecting goat growth traits； its polymorphic loci could be used as effective genetic markers for goat growth traits to guide the molecular breeding of goats.

Key words：Guizhou white goat； L-FABP gene； genetic variation； growth traits

肝臟型脂肪酸结合蛋白（Live fatty acid binding protein， L-FABP）是脂肪酸结合蛋白家族（Fatty acid binding proteins， FABPs）重要组成部分，又称Z-蛋白，亚铁血红素蛋白，是一种与遗传相关的脂肪酸连接蛋白家族成员，在哺乳动物中，主要表达场所是肝脏组织和小肠，在人的肾脏中也有少量表达[1]。L-FABP基因由4个外显子和3个内含子组成，有127个氨基酸残基和2个脂肪酸结合位点，分子量约为144 kDa[2]。L-FABP与FABPs家族成员间氨基酸序列的同源性达3870%，主要由核苷酸链的N端附近两条短的α-螺旋和10条反平行的β-链正交的折叠组成，此外L-FABP 还具有一个特殊打开的β-桶型结构的盖子，β-桶型结构稳定性较强，其空间构型不易发生化学修饰、大分子荧光物质以及基因突变的改变[3]。因L-FABP表达场所主要在肝脏中，所以L-FABP 表达水平的改变可影响脂肪肝、肝硬化以及肝癌的发生发展关系，并有望作为肝损伤早期高敏感检测指标[4-7]。L-FABP还可通过脂肪酸来调控脂肪的沉积影响动物生长，该基因在畜牧生产领域的研究主要集中在其遗传变异与猪肉质性能和鸡脂肪性状及组织表达方面[8-10]。

关于L-FABP基因遗传变异与贵州地方山羊品种的生长性状的相关研究则鲜见报道，本研究以贵州喀斯特地区独特的地方优良山羊品种—贵州白山羊为研究对象，采用DNA池、PCR-SSCP法结合PCR产物直接测序检测L-FABP基因外显子的多态性，分析其遗传变异与生长性状的相关性，为寻找L-FABP基因可能作为影响贵州白山羊生长性状的分子遗传标记提供依据。

1材料与方法

11试验材料

试验用12～48月龄贵州白山羊成年羊223只（公羊为23只，母羊为200只），均来自贵州白山羊的中心产区—贵州省沿河县新景乡，饲养管理、营养水平和免疫程序相同，健康无病。每只试羊颈静脉采血8mL置于EDTA-K2抗凝真空采血管中，颠倒混匀，置于-20℃保存备用。同时按要求详实记录每个个体体重、体高、体斜长、胸围和管围5个生长性状指标数据。

12血液基因组DNA的提取

本试验采用Ezup 柱式基因组DNA 抽提试剂盒（血液），采购于生工生物工程（上海）股份有限公司，按说明书详细进行试羊个体基因组DNA的提取。最后经12%的琼脂糖凝胶检测，稀释成终浓度为100～200ng/L，于-20℃冰箱中保存备用。

13引物设计与合成

根据NCBI中GenBank数据库中山羊L-FABP基因（登录号为NC_0223031，REGION： 4739238147397985）相关序列，利用NCBI中的 Premier -Blast 和Premier 50软件针对该基因全部外显子区设计特异性引物，共设计5对引物（详见表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

变性剂（98%去离子甲酰胺，25mmol/L EDTA，0025%二甲苯青，0025%溴酚蓝），于100℃沸水浴中变性15min，置于-20℃冰箱中保存15min，同时将15%的非变性聚丙烯酰胺凝胶进行250V电压预电泳30min，待点样完成先进行250V电压预电泳30min，后改为120V电压电泳13～15h，最后银染显色判型，挑选不同基因型个体（各3个）的PCR产物送北京诺赛公司和上海英骏生物技术有限公司测序。

15数据处理和统计分析

PCR-SSCP数据分析：统计基因型频率、等位基因频率、多态信息含量、有效等位基因数和群体杂合度，并进行卡方适合性检验。采用SPSS 180软件对数据进行统计和关联分析，建立最小二乘线性模型：Y=μ+G+P+S+G*S + G*P+P*S+e，式中Y为性状表型值，μ 为群体平均值，G为基因型效应，P为群体效应，S为性别效应，G*S 为基因型和性别互作效应， G*P为基因型和群体互作效应，P*S为群体和性别互作效应，e为残差效应。结果以均值±标准差表示。

2结果与分析

21PCR产物检测

用12%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果见图1，扩增片段整齐、单一无拖尾，大小与预期结果一致，表明引物特异性较好，可直接用于下一步试验。

22PCR产物与SSCP检测结果

如图2所示，在贵州白山羊引物L5的PCR 产物中分别检测到C4557T和A4575G两个多态座位，其余引物PCR 产物中未发现多态位点。根据DNA混合池所发现的C4557T位点和A4575G位点（位于内含子2处），设计一对特异性引物，用于下一步进行PCR-SSCP试验，检测群体中每个个体突变位点处基因型（图3所示），在试验群体中检测到2类等位基因，分别为C和T 及A和G，共出现6种合并基因型，分别为CCGG、CTGG、CTAG、CCAA、CTAA和TTGG，其中CCGG为A基因型，CTGG为B基因型，CTAG为C基因型，CCAA为D基因型，CTAA为E基因型，TTGG为F基因型，PCR扩增产物测序峰图详见图4。

23L-FABP基因C4557T和A4575G变异位点群体遗传结构分析

统计分析C4557T和A4575G位点在贵州白山羊公母羊群和全群中的遗传结构，如表2所示，对于L-FABP基因C4557T位点，三个群体（全群、♀和♂）均以C为优势等位基因，其等位基因频率分别为06592、06700和05653，C4557T位点在三个试验群体中的多态信息含量PIC表现均为中度多态（025005），而公羊群X2检验显示该基因型分布处于Hardy-Weinberg 非平衡状态（P<005）。

对于L-FABP基因A4575G位点，该位点存在3种基因型，除公羊基因型分布表现为GG>AG>AA外，其余分布表现为AA>GG>AG。母羊群和全群中，A为优势等位基因，等位基因频率分别为05269和05400，公羊群中，G为优势等位基因，等位基因频率为05870；纯合度较为接近，A4575G位点在三个试验群体中的多态信息含量PIC表现均为中度多态（025005），在公羊群中分布处于Hardy-Weinberg 非平衡状态（P<005）。

24SNPs位点各效应对生长性状的影响

根据固定效应模型分析（表3），L-FABP 基因C4557T位点仅在体斜长中不存在性别效应（P>005），其余指标均存在性别效应（P<005），各指标无基因型效应和基因型和群体互作效应（P>005）；A4575G位点在体重和体斜长中无性别效应（P>005），其余指标均存在性别效应（P>005），总体上各指标均不存在基因型和性别与群体互作效应（P>005）。

25L-FABP基因C4557T和A4575G位点多态座位效应分析

L-FABP基因C4557T和A4575G位点多态座位效应分析结果（表4）：该基因多态座位共得到6种不同的基因型，其中成年羊（♂）基因型CCGG、TTGG和周岁羊（♂）TTGG样本个数为1，相关分析时不予以考虑，而相关分析中无周岁羊（♂）和成年羊（♂）基因型CTAG和CCAA，结果显示，不同多态座位与贵州白山羊各生长指标间差异显著或差异极显著（P<005， 001）。成年羊（♀）基因型CCGG个体的体高和体斜长以及CTAA个体的体斜长极显著和显著高于CCAA个体（P<005，001），而CCGG个体体斜长比CTAA个体高；而CCAA个体管围显著低于CTAG和CTGG个体；其余指标均差异不显著且成年羊（♂）各基因型的各个指标均差异不显著（P>005）。周岁羊（♀） TTGG型个体的体重极显著高于CCGG个体（P< 001），显著高于CCAA个体（P<005），而CCGG个体的体高和胸围显著低于CTAG个体，其管围显著低于CTAA和TTGG，各基因型对体斜长差异不显著（P>005）。周岁羊（♂）基因型CTGG个体的胸围和CTAA个体的管围显著高于CCGG个体（P<005），其余指标均差异不显著（P>005）。

3讨论与结论

31L-FABP基因多态性检测及其遗传结构分析

以贵州白山羊为试验对象进行DNA池筛选多态位点的文献已有报导，包括不同基因的多态性与贵州白山羊的生长性状、肉质性状和血液免疫指标的关联性研究[11-15]。本试验研究在贵州白山羊L-FABP基因共4个外显子处进行多态性检测，结果未在L-FABP基因外显子处筛选出SNPs，而在Intron2处发现C4557T和A4575G两个多态基因座位；在C4557T和A4575G位点处，试验群体的有效等位基因数均接近2，表明所对应的等位基因在群体中分布均匀，三个试验群体位点均处于中度多态。在母羊和全群中分布均符合Hardy-Weinberg平衡，而公羊群中分布则处于Hardy-Weinberg非平衡状态，这可能是由于公羊群选种和选配不平衡，受迁徙因素的影响较大；也有可能是公羊受到高度选择的原因，导致公羊群体偏离了Hardy-Weinberg平衡规律。

32L-FABP基因多态性与山羊生长性状的关联分析

本试验发现L-FABP基因的SNP位点在内含子区域，但其不同基因型对贵州白山羊生长性状仍有关联，说明该基因较为保守，外显子区较难出现突变，而内含子序列对基因表达调控的作用也尚未被阐明，但有可能作为调控元件影响基因表达水平。对L-FABP基因进行固定效应模型分析，发现其多态位点均存在群体效应，而除体斜长外，其余指标均存在性别和群体互作效应，可进行下一步相关性分析。对L-FABP基因 C4557T和A4575G位点多态座位效应分析显示：成年母羊的不同基因型对体高、体斜长和管围指标均差异极显著或显著，而体重是衡量山羊生长发育状况的重要指标，各基因型对体重和胸围指标差异不显著，由此可以推测因各基因型对胸围指标呈差异不显著间接影响了体重指标；周岁母羊的各基因型对其体重、体高、胸围和管围均差异极显著或显著，由此可以验证上面的推测结果，表明各基因型的体重和胸围之间存在一定的关联性。本研究中成年母羊、周岁母羊和公羊的各基因型对管围均差异显著，由此可以推测管围对成年母羊、周岁公羊和母羊的生长有重要影响。

由结果可知，L-FABP基因基因型CCGG有利于提高成年贵州白山羊母羊的体高和体斜长，基因型TTGG为有利于提高周岁贵州白山羊母羊的体重和管围，该基因型对山羊生长性能具有促进作用，可作为促进山羊生长候选基因型应用于贵州白山羊生长性能辅助选育。

致谢：本研究对相关部门的支持表示衷心的感谢！

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