美洲鲥致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及药敏试验

张伟，张铖，贡成良，薛仁宇，柳一方

（1.苏州市阳澄湖现代农业发展有限公司，江苏 苏州 215141；

2.苏州市阳澄湖国家现代农业示范区发展有限公司，江苏 苏州 215141；

3.苏州大学基础医学与生命科学学院，江苏 苏州 215123）

美洲鲥致病性维氏气单胞菌的分离鉴定及药敏试验

张伟1，张铖2，贡成良3，薛仁宇3，柳一方1

（1.苏州市阳澄湖现代农业发展有限公司，江苏 苏州 215141；

2.苏州市阳澄湖国家现代农业示范区发展有限公司，江苏 苏州 215141；

3.苏州大学基础医学与生命科学学院，江苏 苏州 215123）

从自然感染发病的美洲鲥肝脏、肾脏和肠道中分离出1株细菌，经革兰染色镜检及PCR鉴定，确定为维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）。用该菌株接种健康美洲鲥，鉴定其致病力，从人工感染50 g左右的健康美洲鲥发现，菌株具有很强的致病力，试验鱼在感染后72 h内全部死亡，且患病症状与自然发病的鱼症状一致。进一步采用药敏纸片法测定分离菌株对多种抗生素的敏感性，结果发现：维氏气单胞菌对恩诺沙星、氧氟沙星、头孢噻吩三种药物极为敏感，对红霉素、头孢唑啉中度敏感，对青霉素、氨苄西林、阿莫西林、四环素、链霉素不敏感。

美洲鲥；维氏气单胞菌；分离鉴定；药敏试验

维氏气单胞菌又称凡隆气单胞菌、维罗纳气单胞菌，属弧菌科（Vibrionaceae）气单胞菌属（Aeromonas）[1-2]，1983年，美国疾病预防与控制中心为纪念法国微生物学家Veron在弧菌和气单胞菌研究中的贡献而命名。该菌普遍存在于淡水、污水，土壤乃至海水中，其中一部分菌株是微生态环境中正常存在的，而另一些菌株具有致病性[3]。维氏气单胞菌可产生一系列的有毒因子，如气溶素、肠毒素和黏附因子等，这些有毒因子在水产动物、人类甚至畜禽感染中起着举足轻重的作用。近年来，日益增多的病例表明维氏气单胞菌已成为一种重要的人-鱼共患致病菌[4]。

美洲鲥（Alosa sapidissima，鲱形目、鲱科、鲥亚科）是近年来新兴起的一种养殖品种，因其抗病力强、营养与经济价值高等优点而备受广大养殖户欢迎。然而，近年来由于养殖密度大、水质下降、种质退化等原因，其病害发生率明显增加，其中细菌病的暴发是造成美洲鲥经济损失的重要原因之一[5-7]。气单胞菌作为主要的病原菌之一，其发病率及耐药性也逐年增加。本研究从基地养殖池中发病的美洲鲥体内分离细菌，并进行PCR鉴定、致病力试验和药敏研究，以期为临床指导用药提供参考，为该病的防控提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

病鱼（20 g左右）采自苏州市相城区阳澄湖现代农业产业园工厂化基地养殖池，死亡鱼体表可见鳃丝充血，肠道内食糜少或无，肠壁薄，肾脏充血明显，部分有大面积的皮肤溃烂。营养肉汤（NB）、普通营养琼脂（NA）、LB培养基、TSB培养基以及细菌微量生化鉴定管购自北京陆桥技术股份有限公司，水解酪蛋白琼脂（MH琼脂）、抗生素药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 细菌的分离与纯化选择患病个体，先用75%酒精对个体表面进行严格消毒，然后在无菌室中解剖，从肝脏、肠道、肾脏等器官中取样，用75%酒精浸洗、无菌水冲洗，无菌环境下搅碎并放入无菌营养肉汤中进行增菌，28℃恒温培养24 h后蘸取增菌液接种于营养琼脂培养基上，28℃恒温培养24 h，挑取优势菌落二次纯化培养，挑取单菌落划线于营养琼脂斜面，无菌液体石蜡密封后4℃短期储存备用，-80℃长期保种。

1.2.2 细菌的鉴定挑取单个新鲜培养菌落接种于LB液体培养基，37℃培养8 h，离心收集菌体，取新鲜菌液50 μL，煮沸5 min，12 000 r/min离心2 min，取上清液用作模板，用16S rRNA基因的通用引物27F（5'-agagtttgatcctggctcag-3'）/1492R（5'-tacggttaccttgttacgactt-3'）进行PCR扩增。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，用DNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）回收特异性扩增产物。回收产物连接到pMD18-T载体（TaKaRa公司）后，转化大肠杆菌TG1感受态细胞，挑取单菌落，用质粒抽提试剂盒（AXYGEN公司）抽提质粒，酶切鉴定，取阳性克隆送上海生工生物工程有限公司测序。

1.2.3 致病力试验将分离纯化的病原菌接种于TSB液体培养基中，28℃培养16～18 h后制成菌悬液，调整菌液浓度为1×109CFU/mL，人工感染50 g左右美洲鲥以确定病原菌的致病力。将暂养并确定健康的美洲鲥随机抽选20尾，随机分成2组（A、B），每组10尾。无菌注射器腹腔注射健康试验鱼，A组注射菌液，B组作为对照组注射等量的无菌生理盐水，每尾注射剂量为25 μL。A、B两组鱼分别置于单独的水缸中，28℃水温下连续养殖观察1周，记录鱼死亡情况，并从试验组病鱼的病灶组织中再次分离纯化病原菌。

1.2.4 药敏试验采用纸片琼脂扩散法（K-B法），参照美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）制定的相关标准，将菌株用0.85%生理盐水稀释至1.5×108CFU/mL，取200 μL菌悬液均匀涂布于MH琼脂平板（90 mm）上，用无菌镊子将药敏纸片按要求贴在培养基表面，28℃恒温培养24 h后，测定抑菌圈直径，并根据NCCLS的判定标准进行药敏特性分析。

2 结果与分析

2.1 细菌分离及染色镜检

增菌培养之后增菌液变浑浊，在营养琼脂培养基上28℃恒温条件下培养24～48 h，形成圆形、灰白色较不透明、光滑湿润、边缘整齐、直径为2 mm左右的菌落，菌株有β溶血环，革兰染色后镜检为革兰阴性短杆菌。

2.2 PCR鉴定结果

将测序获得的16S rRNA基因序列用在线Blast程序（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行同源搜寻，根据所测序列与GenBank中已公开的细菌16S rRNA基因序列的相似性确定所分离细菌的分类地位。结果显示，所分离的细菌为维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）。

2.3 致病力试验结果

攻毒20 h后，A组鱼开始陆续死亡，游动缓慢，死鱼鳃充血、解剖发现肾脏不同程度充血、肠壁薄、死亡症状与自然发病鱼一致；攻毒48 h后10尾鱼全部死亡。将A组死鱼随机取两条进行剖检，分离细菌进行鉴定，鉴定结果为维氏气单胞菌。B组（CK）攻毒7 d后鱼无死亡。说明分离到的这株维氏气单胞菌具有很强的致病性。

2.4 药敏试验结果

表1 菌株对10种常见药物的敏感性试验结果

用10种常见的药物对分离菌株进行药物敏感性试验，测量抑菌圈直径，计算平均值。由表1可知，该菌株对恩诺沙星、氧氟沙星、头孢噻吩三种药物极为敏感，对红霉素、头孢唑啉中度敏感，对青霉素、氨苄西林、阿莫西林、四环素、链霉素不敏感。

3 讨论

维氏气单胞菌广泛存在于淡水及含有机物的水中、淤泥及淡水鱼体表，健康鱼带菌率高，但有病原不一定会有流行病的发生，要由环境和宿主抵抗力两方面决定[8]，黎炯等[9]认为维氏气单胞菌是一种人畜共患的条件致病菌。近年来关于因感染维氏气单胞菌而致病的报道越来越多，如中华鳖[10]、黄颡鱼[11]、团头鲂[12]、异育银鲫[13]、斑点叉尾鮰等品种[14]。典型案例如浙江省德清县曾由于维氏气单胞菌的感染引起养殖青虾的暴发病，发病率14.6%～60%，病死率71.1%～90%[15]。

试验以美洲鲥为研究对象，发病个体临床症状表现为鳃丝充血，肠道内食糜少或无，肠壁薄，肾脏充血明显，部分有大面积的皮肤溃烂，从其肝脏、肠道、肾脏等器官中分离出一株细菌，经分离、纯化、鉴定为维氏气单胞菌。进一步鉴定其致病力，发现该菌株具有很强的致病力，试验鱼在感染后72 h内全部死亡，且患病症状与自然发病的鱼症状一致，这表明该菌株是导致此次美洲鲥发病的致病菌。

进一步的药敏试验结果表明恩诺沙星、氧氟沙星、头孢噻吩三种药物对维氏气单胞菌有较好的敏感性，而青霉素、链霉素、四环素、阿莫西林和氨苄西林对维氏气单胞菌有较好的耐药性。这可能跟当地传统水产养殖用药情况有关，在用药上大量使用青霉素、链霉素、四环素、阿莫西林和氨苄西林等抗生素，导致该致病菌对以上几种抗生素产生较强的耐药性。而恩诺沙星、氧氟沙星、头孢噻吩三种药物作为近几年新兴的抗菌药物，对维氏气单胞菌仍具有较好的敏感性，这与黎炯等[9]从罗非鱼上和王浩等[16]从草鱼上分离出的维氏气单胞菌药敏试验结果基本一致，这表明目前恩诺沙星、氧氟沙星、头孢噻吩三种药物对美洲鲥维氏气单胞菌病有较好的治疗效果。

然而，美洲鲥目前的养殖技术还不是很成熟，其病害的相关研究也很少，而养殖户为追求高的经济效益，往往养殖密度偏大，管理不到位，导致水质变差，鱼体体质差，使鱼体易遭受病原菌的侵袭，造成批量死亡。因此，加强对养殖用水的消毒净化处理、控制养殖环境是防治该病发生的关键。同时在实际治疗过程中，应充分了解病原菌对药物的敏感性，合理科学用药，避免耐药菌株形成，提高治疗效果。

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Isolation，identification and drug sensitivity test of pathogenic Aeromonas veronii from Alosa sapidissima

Zhang Wei1，Zhang Cheng2，Gong Chengliang3，Xue Renyu3，Liu Yifang1
（1.Suzhou Yangcheng Lake Modern Agricultural Development Co.，Ltd.，Yangcheng Lake 215141，China；2.The State of Modern Agricultural Demonstration Zone Development Co.，Ltd.in Suzhou Yangcheng Lake，Suzhou 215141，China; 3.School of Biology and Basic Medical Science of Soochow University，Suzhou 215123，China）

A bacterial strain was isolated from liver，kidney and intestinal tract of natural infected Alosa sapidissima，and it was identified to be Aeromonas veronii by gram staining and PCR identification.This bacterial strain was used to artificially infect healthy Alosa sapidissima weighed about 50 grams，all infected fish died in 72 hours and the symptoms of the infected fish were consistent with the natural diseased fish.The results of drug sensitivity test shows that this strain of Aeromonas veronii was extremely sensitive to enrofloxacin，ofloxacin and cephalothin，and it was sensitive to erythromycin and cefamedinⅤ，it was insensitive to peillin G，ampicillin，amoxicillin，tetracycline and streptomycin.

Alosa sapidissima；Aeromonas veronii；isolation and identification；drug sensitivity

S943

A

1004-2091（2017）04-0012-04

10.3969/j.issn.1004-2091.2017.04.003

2016-07-26）

阳澄湖农业人才计划项目（XNY20150203）

张伟（1982-），男，工程师，主要从事水产养殖.E-mail:skyzhang820706@163.com