白山市鸭绿江网箱养鲤冰下爆发锦鲤疱疹病毒病的鉴定

高立容，于慧，周井祥

（1.长春市水产品质量安全检测中心，吉林 长春 130033；2.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118）

白山市鸭绿江网箱养鲤冰下爆发锦鲤疱疹病毒病的鉴定

高立容1，于慧2，周井祥2

（1.长春市水产品质量安全检测中心，吉林 长春 130033；2.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118）

锦鲤疱疹病毒病（Kio herpesvirus disease，KHVD）是由锦鲤疱疹病毒（Kio herpesvirus，KHV）引起的鲤（Cyprinus carpio L）、锦鲤、框镜鲤的一种高传染率和致死率的疾病，发病季节多为春秋季，常发水温为18～28℃。2015年3月初，低温条件下，吉林省白山市鸭绿江某网箱养殖场鲤鱼大量死亡，其因不明。本实验采用PCR方法进行鉴定，对其编码的膜糖蛋白基因ORF25和囊膜蛋白ORF81基因进行检测，测序结果显示该病毒的目的基因片段与KHV-cj同源性达96%。综上所述，可判定该养殖场鲤爆发的疾病为锦鲤疱疹病毒病。目前该病在低温下爆发的报道还比较少，因此本实验为锦鲤疱疹病毒病爆发的温度条件提供了参考，同时也为该病的防治提出了一些措施及建议。

锦鲤疱疹病毒；网箱养殖；冰下

锦鲤疱疹病毒病是由锦鲤疱疹病毒引起的一种急性鱼类传染性疾病，1997年在以色列首次发现，曾在瑞典、英国、德国、美国、印尼和中国台湾等十几个国家和地区先后传播与流行[1-5]。从2003年开始，我国东北地区的框镜鲤和普通鲤鱼爆发该病，病死率高达80%～90%。锦鲤疱疹病毒病是世界动物卫生组织（Office International Des Epizooties，OIE）必报疫病。由于其传染性强与致死率高，2007年我国质检总局将锦鲤疱疹病毒作为必检项目。

锦鲤疱疹病毒为双股的线形DNA病毒，是鱼类疱疹病毒中基因组最大的病毒[6]。锦鲤疱疹病毒有156个开放性阅读框（ORF），研究较多的有ORF25、ORF81和ORF83，这些基因主要在细胞质中表达，ORF25主要编码膜糖蛋白，ORF81主要编码囊膜蛋白[7-9]，因此本实验采用ORF25和ORF81两个基因进行检测。

锦鲤疱疹病毒病在水温为18～28℃时多发，该病鲜少有在低温下爆发的报道。2015年3月初，吉林省白山市鸭绿江某网箱养殖场鲤鱼出现不明原因大量死亡情况，病鱼体色暗淡、灰白色、眼微凹，初步判定为锦鲤疱疹病毒病，实验室从该养殖场采集病鱼样品，进行实验室鉴定。

1 材料

1.1 病料来源

2015年3月初，实验室从白山市鸭绿江某网箱养殖场采集病鲤。该批病鲤平均体质量为（1 200± 15）g，平均体长为（28±2）cm。

1.2 实验试剂

试剂主要有：蛋白酶K、无水乙醇、70%乙醇、液氮、裂解缓冲液（Tris-HCl、NaCl、EDTA、SDS）、氯仿∶异戊醇=24∶1（Tris-HCl、EDTA）、PBS缓冲液、苯酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1、Tris饱和酚、TE溶液、琼脂糖（Biowest Spain）、D2000 Marker（北京Solarbio科技有限公司）、琼脂糖凝胶回收试剂盒（AxygenBiosciences）。

1.3 实验仪器

无菌解剖刀、无菌剪刀、研钵、梯度PCR仪、离心机、（Eppendorf AG 22331 Hamburg）、电泳槽及电泳仪（北京六一仪器公司）、凝胶成像系统（GelDoc-It 310 Imaging system）。

2 方法

2.1 临床诊断

2.1.1 视检观察病鱼体表对其症状进行初步判定。

2.1.2 剖检将病鱼解剖，观察其内脏等器官病变情况。

2.2 实验室诊断

2.2.1 肾脏组织病毒基因组提取将患病鲤鱼解剖取肾组织，用适量PBS缓冲液冲洗干净，无菌剪刀剪碎，放入研钵加液氮研磨成粉末。参照文献[10]改进方法：①取粉末于2 mL Eppendof管中。②加蛋白酶K和裂解缓冲液在56℃水浴中4 h。③加入等体积的Tris饱和酚，混合均匀后10 000 r/min离心10 min，取上层液。④加入等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇=25∶24∶1溶液，混合均匀后离心取上清液。⑤在上清液中加入等体积的氯仿：异戊醇=24∶1溶液，轻轻摇匀，10 000 r/min，5 min，离心弃去上清液。⑥加入2.5倍体积的无水乙醇静置后再加入70%乙醇，离心弃去乙醇。⑦加TE溶液溶解过夜。

2.2.2 PCR扩增及鉴定根据GenBank公布的KHV全基因序列中ORF81设计的引物为P1：5'-GGATCCATGGCAGTCACCAAAG-3'；P2：5'-GTCGACTCACCACATCTTGCCG-3'；ORF25设计的引物为P1：5'-GATATCATGACGGGTTGTGGGGTT-3'；P2：5'-GAATTCTTAGGGCCTCCGGGA-3'。PCR扩增产物预期分别为771 bp，144 bp。

参照朱霞等[11]病毒DNA提取方法提取病毒DNA并进行PCR扩增。ORF81PCR反应条件：预变性95℃5 min；变性94℃40 s；退火64.5℃30 s；延伸72℃1 min；共30个循环。ORF25PCR反应条件：预变性95℃5 min;变性94℃40 s；退火60℃30 s；延伸72℃1 min；共30个循环。产物于4℃下保存。

2.2.3 目的基因的回收配置1%琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后切下目的片段，用琼脂糖凝胶回收试剂盒（AxygenBiosciences）[12]回收目的片段。

2.2.4 目的片段测序取ORF81回收产物20 μL送到上海生工生物技术有限公司测序。

3 结果与分析

3.1 患病鱼主要症状

通过视检观察，体表通常会出血，局部会溃疡，鳞片松动甚至脱落；鳃盖鳃丝出血，鳃丝末端糜烂坏死；鳍条部分充血、出血，尾鳍通常有白色黏液覆盖；病鱼肛门发红肿胀。剖检可见：病鱼血液在几秒时间内迅速凝固；肠道发硬充血，胆囊萎缩，胆汁颜色加深；肝脏、肾脏肿大伴有出血点，肝脏易碎。见图1。

3.2 PCR扩增结果

以患病鲤鱼的肾脏DNA为模板，根据设计的引物来进行PCR扩增并通过琼脂凝胶系统检测。在电泳图上显示扩增出大约771 bp（图2）与144 bp的目的片段（图3）。初步判定该养殖场鲤鱼患上的是锦鲤疱疹病毒病。

3.3 ORF81目的片段测序结果

将ORF81回收产物送至上海生工生物技术有限公司测序，结果如图4，经过BLAST比对，如图5。测序结果和KHV-cj开放阅读框ORF81相应序列同源性达到96%。可以确定该养殖场鲤鱼患上的是锦鲤疱疹病毒病。

4 讨论

通过临床诊断和实验室诊断，可以确定该养殖场鲤鱼感染的是锦鲤疱疹病毒病。据报道[13]锦鲤疱疹病毒病在我国东北三省的发病水温在18～30℃之间，鲜少有在冰下发病的报道，在3月份吉林省的水体还处于冰冻状态，因此实验结果表明了锦鲤疱疹病毒病可以在低温下爆发。打破了常规认为的温度范围，在目前对于该病的感染机制尚未明确的情况下，为该病爆发的温度条件提供了一定的参考，为生产上预防治疗提供了方向，对于其感染机制的研究具有一定的参考价值。

目前我国对锦鲤疱疹病毒病的研究尚处于发展阶段，对其感染机制等生物学信息还需深入研究，并且仍然没有一个有效的治疗方法，因此对于该病仍以预防为主，建议采取综合防治方法：①开展流行病学调查，调查该病易发条件，及时预警，发现立即上报；②加强检测检疫，坚决不从疫区引进苗种；③在饲养管理上注意消毒，改善养殖水体，控制病原，驯化加强鱼类体质；④发现病鱼及时隔离。对该养殖场建议在发病季节前适当投喂免疫增强剂，加强鲤鱼体质；注意消毒养殖环境和养殖工具，养殖工具不混用；减少鱼类应激；发现死鱼及时清除，加漂白粉或生石灰作深埋处理；封冰季节及时清除冰上积雪，保证充足溶氧。

图1 患病鱼图片

图2 PCR扩增目的片段电泳图

图3 PCR扩增目的片段电泳图

图4 目的基因序列

图5 BLAST比对结果

[1]Gilad O，Yuns，Andree B.Initial characterristics of Kio herpersvirus and development of a polymerase chain reaction assay to detect the virus in Kio，Cyprinus carpio Kio[J].Dis Aqua Org，2002，48（2）：101-108.

[2]刘荭，史秀杰，高隆英，等.进口锦鲤爆发病病原的nested-PCR鉴定[J].华中农业大学学报，2002，21（5）：414-418.

[3]Donglim C，Sanggyu S，Banget J D，et al.Ultrastructoiral identification of a herpes-like virus infection in common carp Cyprinus carpio in Korea[J].Diseases of Aquatic Organisms，2004（61）：165-168.

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[5]Gilad O，Yun S，Zagmutt-Vergara F.J.Concentrations of a kio as assesse by real-time TaqMan PCR[J].Diseases of Aquatic Organisms，2004（60）：179-187.

[6]Pikarsky E，Ronen A，Abramowitz J，et al.Pathogenesis of acute viral disease induced in fish by carp in-terstitial nephritis and gill necrosis[J].Journal of Virology，2004（78）：9544-9551.

[7]朱霞，王好，周井祥，等.锦鲤疱疹病毒病的研究进展[J].中国兽医科学，2011，41（1）：106-110.

[8]孟庆峰，钱爱东，王伟利.检测锦鲤疱疹病毒方法的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医，2012（17）：27-29.

[9]刘宗晓，刘荭，江育林.锦鲤疱疹病毒病的研究进展[J].检验检疫科学，2006（04）:77-80.

[10]丛娟，张清元，李建民，等.PCR检测技术中石蜡包埋组织DNA提取方法比较[J].肿瘤研究与临床，1999，11（2）：86.

[11]朱霞，李新伟，王好，等.一株锦鲤疱疹病毒的分离与鉴定[J].中国预防兽医学报.2011（05）：340-343.

[12]邢程，王好，周井祥，等.一例冰下低温爆发的锦鲤疱疹病毒病的鉴定[J].水产学杂志，2014（01）：46-49.

[13]刘敏，唐绍林，张恒.鲤鱼患锦鲤疱疹病毒病的诊断和防控[J].科学养鱼.2012（12）：61-62.

Identification of Koi herpesvirus disease outbreak under ice in carp cage cultured in baishan，the Yalu River

Gao Lirong1，Yu Hui2，Zhou Jingxiang2
（1.Changchun city aquatic products quality and safety testing center，Changchun 130118，China；2.College of Animal Science and Technology，Jilin Agricultural University，Changchun 130118，China）

Koi herpesvirus disease（Kio herpesvirus diseases，KHVD）is a koi herpesvirus（Kio herpesvirus，KHV）of carp（Cyprinus），brocade carp，frame mirror carp a high infection rate and fatality rate of disease，pathogenesis season is age season more，often send water temperature for 18 to 28℃.In early March 2015，under the conditions of low temperature，a large amount of carp died in a cage farm in Yalu River，Baishan City，Jilin Province and the reason was unknown.In this study，the polymerase chain reaction（PCR）was used to identify the membrane glycoprotein gene ORF25 and envelope protein ORF81 gene，the purpose of the sequencing results showed that the virus gene fragment and KHV-cj homology of 96%.In summary，it could be determine the outbreak of the farm carp disease for Koi herpes virus disease.At present，the disease has been reported at low temperature，so this experiment provides a reference for the temperature condition of Kio herpesvirus outbreak，and also puts forward some measures and suggestions for the prevention and cure of the disease.

Kio herpesvirus；cage culture;under-ice

S943

A

1004-2091（2017）04-0007-05

10.3969/j.issn.1004-2091.2017.04.002

2016-06-14）

吉林省科技发展计划疫苗研制与示范（20120228）

高立容（1965-），女，高工，研究方向为水产养殖.E-mail：412733526@qq.com

周井祥（1965-），男，正高.E-mail：zhjxnd@126.com