海洋枝顶孢霉BH0531发酵液对根结线虫卵及二龄幼虫的影响

申佩娟，苗利华，李娜，刘晓霞，冯欣，2，孟庆恒，2*，孙建华，2

（1.天津师范大学生命科学学院，天津300387；2.天津市动植物抗性重点实验室，天津300387）

海洋枝顶孢霉BH0531发酵液对根结线虫卵及二龄幼虫的影响

申佩娟1，苗利华1，李娜1，刘晓霞1，冯欣1，2，孟庆恒1，2*，孙建华1，2

（1.天津师范大学生命科学学院，天津300387；2.天津市动植物抗性重点实验室，天津300387）

实验以根结线虫的卵、卵囊和二龄幼虫（J2）为研究对象，对海洋枝顶孢霉（Acremoniumsp.）BH0531发酵液处理根结线虫不同发育阶段的杀线作用进行了效果评价，并以J2幼虫为靶标，与市面上的灭线磷及阿维菌素的药效进行了初步对比。结果显示，在实验条件下，海洋枝顶孢霉BH0531发酵液对根结线虫卵囊和分散卵的孵化以及J2幼虫的活力均具有明显抑制作用，其对卵囊孵化的抑制作用达40.18%；对分散卵孵化的抑制作用可达84.28%；而对J2幼虫的杀线作用最为显著，校正死亡率高达97.41%，高于实验条件下灭线磷及阿维菌素的测定值，在根结线虫的生物防控方面显现出潜在的研究价值。

海洋枝顶孢霉BH0531；根结线虫；卵孵化；二龄幼虫；抑制作用

根结线虫（Meloidogynespp.）是植物寄生线虫中种类最多、分布最广且危害最严重的一类线虫[1]。其中南方根结线虫（Meloidogyne incognita）、花生根结线虫（Meloidogyne arenaria）、爪哇根结线虫（Meloidugyne javanica）和北方根结线虫（Meloidogyne hapla）4种线虫的危害最为严重，占根结线虫危害的90%以上[2-3]，涉及114科3 000多种寄主植物[4]，其防治任重而道远。

目前，根结线虫的防治仍以化学防治为主要手段，但是其在环境友好和可持续发展方面存在明显的缺陷。因此，根结线虫的生物防治受到了越来越多的关注，且有淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）和阿维菌素[5]已应用于实践。理想的生防制剂应具备杀线效果好，水溶好、耐热、pH范围相对宽泛以适应不同土壤环境，并能促进植物生长等优势。以松材线虫（Bursaphelenchusxylophilus）为靶标筛选出来的海洋枝顶孢霉（Acremoniumsp.）BH0531代谢物不仅具有明确的杀线作用，还具有分子质量小、水溶性好且耐热，与大多数土壤环境相符的pH适应范围的特点[6]。进一步的黄瓜盆栽实验结果显示，该菌所产生的活性代谢物对南方根结线虫（Meloidogyne incognita）同样有明确的杀线活性，并使根结指数明显降低，同时还具有改善土壤微生态环境的作用[7]；相关研究还发现，发酵液对染病植株的生长及保护酶具有促进作用[8-9]，而对线虫体内保护酶则呈现出抑制作用[10]。为进一步探究其对线虫发挥作用的具体阶段，本研究以根结线虫的卵、卵囊和二龄幼虫（J2）为研究对象，采用室内浸渍方法，对该菌发酵液在线虫不同发育阶段的杀线作用进行了效果评价，并以J2幼虫为靶标，与灭线磷和阿维菌素的效果进行了初步比较，旨在为进一步揭示其作用机理提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌种及线虫

海洋枝顶孢霉（Acremoniumsp.）BH0531，菌种保藏号CGMCC-5445，由天津师范大学生命科学学院微生物实验室提供。南方根结线虫（Meloidogyne incognita）、虫卵、卵囊和二龄幼虫（J2）：采自天津市宝坻区城关镇圣人庄黄瓜蔬菜大棚。

1.1.2 化学试剂

阿维菌素（abamectin）乳油：河北省伊诺化工有限公司；灭线磷（ethoprophos）乳油：北京中国农科院植物保护所研制；葡萄糖、蔗糖、次氯酸钠（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；琼脂：天津市化学试剂厂三厂；无水乙醇（分析纯）：天津市化学试剂厂二厂。

1.1.3 供试培养基

斜面培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：去皮土豆（浸汁）200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15 g/L，pH自然，121℃灭菌20 min。

发酵培养基：去皮土豆（浸汁）200 g/L，葡萄糖20 g/L，pH自然，121℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

LDZ5-2雷勃尔离心机：北京雷勃尔离心机有限公司；SPX-250B-Z生化培养箱、G2X-9140MBE数显鼓风干燥箱：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-1F超净工作台：苏州净化设备有限公司；HZ-2010K控温摇瓶柜：上海欣蕊自动化设备有限公司；YXQG02型电热式灭菌锅：山东新华医疗器械厂；XTL500解剖镜、XTB-A5538体式显微镜：桂林光学仪器厂；USOS-503型中空纤维素膜组件：天津膜天膜工程技术有限公司；线虫标准筛：浙江上虞市公路仪器厂；48孔、96孔细胞培养板：美国康宁公司。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵液的制备

菌种活化：将保藏的海洋枝顶孢霉（Acremoniumsp.）菌种接入斜面培养基，26℃静置培养6～7 d。

孢子悬浮液的制备：取新培养的菌株斜面，加入无菌水洗下孢子，制备成1×106个/mL的孢子悬浮液。

发酵液的制备：以2%接种量将孢子悬浮液接入装液量为50 mL/250mL液体发酵培养基中。26℃、120 r/min培养4 d。将培养好的菌液10 000 r/min离心除去菌体，经孔径为0.22 μm微孔滤膜真空抽滤除菌，再经截留分子质量为6 000 u的中空纤维素膜组件过滤，收集小分子滤液即为小分子发酵滤，60℃真空蒸干浓缩，备用。

1.3.2 根结线虫的获取

根结线虫卵囊的制备：参见BIESMEIJER J C等[11]的方法，取病根于解剖镜下挑取大小较为一致的卵囊，用0.5%的次氯酸钠表面消毒3～5 min，再用无菌水漂洗3～4次，去除残留的次氯酸钠，备用。

根结线虫分散卵制备：采用改良的振荡法分离线虫。将病根剪成1～2 cm的小段，加入1%体积分数的次氯酸钠溶液，用粉碎机粉碎。分别过100目、300目和500目分样筛，收集500目分样筛截留物，即为根结线虫卵粗提物。虫卵粗提物悬于40%的蔗糖溶液上层，3 500 r/min、5 min条件下离心，交界面的白色悬浮物即虫卵，用移液器吸出，洗掉糖液，配制成1 000个/mL，备用[8]。

根结线虫J2幼虫的制备：将虫卵放入25℃培养箱中培养，待虫卵孵化，采用贝尔曼漏斗法收集2龄幼虫，配制成1 000条/mL，备用[8]。

1.3.3 根结线虫卵囊卵孵化率的测定

借鉴GIANNAKOU I O等[12]的浸渍法测定：取浓度为浓缩16倍、浓缩4倍、原液、稀释4倍、稀释16倍的发酵液各500 μL分别注入48孔板各孔，各置入一个卵囊，以无菌水为空白对照，每个处理3个重复。于21℃条件下培养6 d，每天稍微振荡一下保证通气。剖开卵囊计未孵化数，计算卵总数（显微镜下计数器计数），各个处理组的孵化率及其对应的相对抑制率计算公式如下：

1.3.4 根结线虫分散卵孵化率的测定

取浓度分别为浓缩16倍、浓缩4倍、原液、稀释4倍、稀释16倍的发酵液各100 μL分别注入96孔各孔，各置入100 μL处理好的分散卵悬浮液，以无菌水为对照，每个处理3个重复。于21℃培养箱中培养6 d，每天稍微振荡一下保证通气。在显微镜下计数并处理数据得到各处理的孵化率及其对应的相对孵化抑制率。

1.3.5 不同杀线剂对根结线虫二龄幼虫的杀线率的测定

按表1设置浓度[13-14]分别向96孔板各孔加入100 μL药液，再加入等体积的根结二龄线虫（J2）悬浮液100 μL，以无菌水为对照，每个处理3个重复（见表1）。于26℃条件下培养5 d，于显微镜下计数，死亡率、校正死亡率计算公式如下[15]：

表1 实验设计与处理Table 1 Design and treatment of the experiments

1.3.6 数据处理

应用SPSS Statistics 17.0软件对实验结果进行统计分析，差异性显著分析和采用概率单位法（PROBIT模型）计算出供试药液的回归方程及半数致死量（50%lethal dose，LD50）值、95%的置信区间。

2 结果与分析

2.1 发酵液对根结线虫卵囊卵孵化的抑制作用

由图1可知，枝顶孢霉（Acremoniumsp.）BH0531发酵液对根结线虫卵囊的卵的孵化有较为明显的抑制效果，4倍浓缩液条件下卵的孵化率为34.66%，较对照降低了20.96%。除16倍稀释液外，其余各浓度发酵液与对照相比均存在显著差异（P＜0.05），孵化率均明显低于对照组。显示出该发酵液对卵囊中卵的孵化具有明确的抑制作用。实验结果表明，抑制效果与发酵液浓度成正相关效应。值得注意的是，过高的浓度对卵囊的外膜物质可能会产生钝化作用。

图1 枝顶孢霉BH0531发酵液对根结线虫卵囊的孵化率的影响Fig.1 Effect ofAcremoniumsp.BH0531 fermentation broth on hatching rate of egg masses from root-knot nematodes

2.2 发酵液对根结线虫分散卵孵化的抑制作用

由图2可知，枝顶孢霉（Acremoniumsp.）BH0531发酵液对分散卵孵化具有明显的抑制作用，高浓度（16倍浓缩液）条件下卵的孵化率仅为8.31%，较对照降低了66.46%。除16倍稀释液外，其余各浓度发酵液与对照相比均存在显著差异（P＜0.05），且孵化率均明显低于清水组。结果表明，该发酵液对分散卵的孵化具有明确的抑制作用，且其抑制效果与发酵液浓度呈正相关效应。此外，高浓度发酵液对分散卵的相对孵化抑制作用明显高于对卵囊的相对孵化抑制作用。

图2 枝顶孢霉BH0531发酵液对根结线虫分散卵孵化率的影响Fig.2 Effect ofAcremoniumsp.BH0531 fermentation broth on hatching rate of individual eggs from root-knot nematodes

2.3 发酵液与灭线磷和阿维菌素对根结线虫J2的杀线效果比较

枝顶孢霉（Acremoniumsp.）BH0531发酵液与灭线磷和阿维菌素对根结线虫J2的杀线效果比较结果见表2。

表2 枝顶孢霉BH0531发酵液对根结线虫二龄幼虫作用影响Table 2 Effect ofAcremoniumsp.BH0531 fermentation broth on J2 of root-knot nematodes

由表2可知，不同浓度的枝顶孢霉BH0531发酵液、灭线磷和阿维菌素对根结线虫J2的活性均有较高的抑制作用，校正死亡率均高于70%。每种药液的各个浓度之间对根结线虫J2活性的影响差异显著（P＜0.05），同样表现出浓度相关性。在设定的实验范围内，最高杀线率出现在BH0531发酵液的4倍浓缩液组，校正死亡率高达97.81%。而实验条件下40%灭线磷和1.8%阿维菌素EC的最高杀线率均未＞90%，且三种药液实验条件下的最高校正死亡率组间表现出极显著性差异（P＜0.01）。结果表明，枝顶孢霉BH0531发酵液的在根结线虫防治上应用的潜在优势。

3 结论

本研究以松材线虫为靶标线虫，所筛选出的海洋真菌枝顶孢霉（Acremoniumsp.）BH0531其发酵液对根结线虫同样具有明确的杀线作用，该发酵液对根结线虫二龄幼虫J2的作用最为显著，可高达97.81%，达到A级水平（≥90%）；其次表现为对分散卵的孵化抑制作用，抑制率高达84.28%，而对卵囊中卵的抑制作用也达40.18%。发酵液的作用效果与活性物质的浓度和线虫的裸露程度，以及生理活力程度有关，呈现出浓度越高，杀线率/孵化抑制率越高的一般规律。另一方面，相对于J2幼虫，分散卵和卵囊的裸露程度及生理活力程度递减，其作用效果也随之降低。这可能与卵外的胶质层相关，胶质层能有效的保护卵囊中的卵粒[16]。与市面上的杀线剂灭线磷和阿维菌素进行对比的实验结果显示，尽管最高杀线活性（97.81%）是在发酵液处理组，但从LD50的测定值来看，发酵液在实验条件下的用量远大于2种市售杀线剂，表明发酵液有效活性物质净含量还比较低，因此，进一步优化发酵条件，提高活性物质产量，并对有效活性物质进行分离纯化和鉴定已成为今后开发及充分利用的关键。

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Effect of fermentation broth of marine-derivedAcremoniumsp.BH0531 on egg and 2ndstage juveniles of root-knot nematodes

SHEN Peijuan1,MIAO Lihua1,LI Na1,LIU Xiaoxia1,FENG Xin1,2,MENG Qingheng1,2*,SUN Jianhua1,2
(1.College of Life Science,Tianjin Normal University,Tianjin 300387,China; 2.Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance,Tianjin 300387,China)

Using the eggs,egg masses and 2ndstage juveniles(J2)of root-knot nematodes as research object,the nematicidal effect of fermentation broth of marine-derivedAcremoniumsp.BH0531 on root-knot nematodes of different development stages was evaluated.With the J2 as target,the pesticide effect of fermentation broth was compared with ethoprophos and abamectin sold on the market.The results showed that under the experimental conditions,the fermentation broth of marine-derivedAcremoniumsp.BH0531 all had obvious inhibitory effect on the vitality of egg masses, individual eggs hatching and J2,and the inhibiting effect of fermentation broth on egg masses,individual eggs hatching were 40.18%and 84.28%, respectively.The nematicidal effect on J2 was the most significant,the corrected death rate was up to 97.41%,which was higher than that of ethoprophos and abamectin under the experimental conditions.These results suggested that the fermentation broth of marine-derivedAcremoniumsp. BH0531 had its potential value in the bio-control of root-knot nematode.

marine-derivedAcremoniumsp.BH0531;root-knot nematodes;egg hatching;2ndstage juveniles;inhibiting effect

Q939.9；S432.4

0254-5071（2017）04-0026-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.006

2017-01-01

国家自然科学基金资助项目（31272019）；天津市自然基金联合项目（15JCYBJC51400）

申佩娟（1989-），女，硕士研究生，研究方向为微生物的活性物质。

*通讯作者：孟庆恒（1963-），副教授，硕士，研究方向为应用微生物。