性质可比自微乳处方的制备、筛选及其对白藜芦醇增溶能力的研究

刘志浩，吕 侠，宋慧一，张建斌

(1. 大连医科大学 药学院，辽宁 大连 116044；2. 大连民族大学 生命科学学院， 辽宁 大连 116600；3. 大连医科大学附属第一医院 中西医结合临床重点学科实验室，辽宁 大连 116011)



论 著

性质可比自微乳处方的制备、筛选及其对白藜芦醇增溶能力的研究

刘志浩1，吕 侠2，宋慧一3，张建斌1

(1. 大连医科大学 药学院，辽宁 大连 116044；2. 大连民族大学 生命科学学院， 辽宁 大连 116600；3. 大连医科大学附属第一医院 中西医结合临床重点学科实验室，辽宁 大连 116011)

目的 通过制备一系列不同油相组成的自微乳处方，从中筛选出能形成相近粒径、表面电荷和均一性微乳的可比处方，进一步考察其对白藜芦醇的增溶能力。方法 分别以中链脂肪酸甘油酯、长链脂肪酸甘油酯和非甘油三脂肪酸酯为油相，通过伪三元相图法确定微乳区，并利用纳米粒度电位分析仪测定所得微乳的粒径、多分散性和Zeta电位，从中筛选出性质可比自微乳处方；通过HPLC测定自微乳及稀释后微乳对白藜芦醇的增溶能力。结果 通过筛选，选择了4种自微乳处方，其中油相为MCT(60%)或蓖麻油(40%)的微乳处方，粒径为140 nm左右；油相为MCT(40%)或油酸乙酯(40%)的微乳处方，粒径为60 nm左右。所得自微乳处方对白藜芦醇的增溶能力达到其水溶解度的8000倍左右。结论 本研究获得了一系列具有可比性的自微乳处方：当组分相同时，所得微乳粒径及分散性差别较大；当组分不同时，所得微乳粒径及分散性相近，可以用于考察微乳性质对药物生物利用度的影响。

自微乳给药系统；白藜芦醇；增溶；粒径；多分散性

白藜芦醇(Resveratrol)是一种天然多酚类化合物，具有多种药理活性作用，包括抗心血管疾病、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗菌、保肝、保护神经系统、抗衰老和雌性激素样作用等[1]。由于白藜芦醇多种有益人体的药理作用，许多国家将其应用于医药、保健品、化妆品和食品添加剂等领域，并将其作为膳食补充剂进行推广，具有巨大的应用价值和市场前景。然而，溶解度过低的问题严重影响了白藜芦醇的吸收。研究表明，白藜芦醇在人体内的口服生物利用度不足1%。针对该问题，采用新剂型技术提高其溶解度，是提高其口服生物利用度的有效手段[2]。

自诺华公司生产的新山地明(Neoral)上市以来，自微乳给药系统(Self-Emulsifying Drug Delivery Systems，SMEDDS)的研究越来越受到关注[3]。自微乳给药系统由油、表面活性剂和助表面活性剂以适当比例组成，其在胃肠蠕动或温和搅拌下能自发形成粒径10～200 nm、各向同性的透明或半透明O/W型分散体系[4]。自微乳给药系统能显著提高难溶性药物(尤其是脂溶性药物)的口服生物利用度，其机制包括提高药物溶解度、提高药物溶出度、增加肠渗透性、促进淋巴吸收以及抑制P-gp外排[5]。

在实际应用中，药物口服生物利用度受到自微乳多种性质的影响，包括自微乳组分种类，所形成微乳的粒径、表面带电性以及均一性，胃肠道稳定性等[6-9]。自微乳的各个性质对药物口服吸收利用度的单独影响的研究尚不深入，导致在设计自微乳处方设计主要依靠经验，处方筛选存在一定盲目性[10]。因此，有必要制备一系列具有可比性的自微乳，通过单因素考察各性质对药物吸收的影响，以更好的指导自微乳处方设计。本研究旨在制备一系列不同油相组成的自微乳处方，从中筛选出能形成相近粒径、表面电荷和均一性微乳的性质可比处方，并进一步考察所选处方对难溶性药物白藜芦醇的增溶能力，以实现提高其口服生物利用度的目的。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

聚氧乙烯氢化蓖麻油(Cremophor RH40，药用级，沈阳普瑞兴精细化工有限公司)；中链甘油三酸酯 (MCT,药用级，建德市千岛精细化工实业有限公司)；油酸乙酯(Ethyl Oleate，分析纯，天津光复精细化工研究所)；蓖麻油(Castor oil，化学纯，天津市大茂化学试剂厂)；1,2-丙二醇(1,2-Propanediol，分析纯，天津市大茂化学试剂厂)；橄榄油(Olive oil，化学纯，国药集团化学试剂有限公司)；肉豆蔻酸异丙酯(Isopropyl myristate，IPM, 化学纯, 国药集团化学试剂有限公司)；油酸(Oleic acid，化学纯，天津博迪化工有限公司)；纳米粒度电位分析仪(Zetasizer Nano ZS90，Malvern，UK)；离心机(Heraeus Labofuge 400R，Thermo scientific，Germany)；磁力搅拌器(79-2，常州国华电器有限公司)；涡旋震荡器(XW-80A，上海精科实业有限公司)；高效液相色谱(Waters e2695, Milford, USA)；全温震荡培养箱(HZQ-F，哈尔滨东联电子技术开发有限公司)。

1.2 方 法

1.2.1 伪三元相图绘制

选择聚氧乙烯氢化蓖麻油作为表面活性剂，1,2-丙二醇作为助表面活性剂，表面活性剂与助表面活性按照2∶1(w/w)的比例混合，作为混合表面活性剂(Smix)。将Smix和MCT分别按照9∶1，8∶2, 7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9(w/w)的比例加入到玻璃小瓶中。将上述混合物置于磁力搅拌器上搅拌2 h，使其混合均匀。最后取1 g上述混合物，并逐滴加入去离子水，涡旋震荡2 min后静置观察形态，观察到蓝色乳光现象说明为微乳态，以此绘制伪三元相图。

1.2.2 不同油相SMEDDS的评价与筛选

分别选择中链脂肪酸甘油酯(MCT)，长链脂肪酸甘油酯(橄榄油和蓖麻油)以及脂肪酸一元醇酯(肉豆蔻酸异丙酯和油酸乙酯)作为油相。将聚氧乙烯氢化蓖麻油和1,2-丙二醇按2∶1(w/w)混合后，制得Smix。将MCT、橄榄油、蓖麻油、肉豆蔻酸异丙酯和油酸乙酯分别与Smix按照9∶1，8∶2, 7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9(w/w)的比例混合后，置于磁力搅拌器上搅拌2 h，即得候选自微乳处方。

取上述处方各1 g，加入烧杯中并用99 mL去离子水稀释100倍，置于磁力搅拌器上搅拌30 min，分别取2 mL稀释后样品用纳米粒度电位分析仪测定所得粒子的粒径、多分散系数(PDI)和Zeta电位。判定粒径小于200 nm的、有淡蓝色乳光的、透明或半透明溶液为微乳液。

1.2.3 性质可比自微乳处方的制备

首先，将聚氧乙烯氢化蓖麻油和1,2-丙二醇按2∶1(w/w)混合后，制得Smix。然后将Smix与MCT以4∶6和6∶4(w/w)的比例混合，磁力搅拌2 h，制得SME-1和SME-2。将Smix分别于油酸乙酯和蓖麻油以6∶4(w/w)的比例混合，磁力搅拌2 h，制得SME-3和SME-4。

1.2.4 HPLC法测定白藜芦醇含量

色谱条件：色谱柱为依利特SinoChrom ODS-BP C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相为甲醇-水溶液(60∶40, v/v)；体积流量为0.8 mL/min；进样量为20 μL；检测波长为308 nm。

标准曲线的绘制：精确称取白藜芦醇原料药5 mg，溶于适量甲醇中并定容于10 mL容量瓶中，作为白藜芦醇储备液。分别称取白藜芦醇储备液0.02, 0.1, 0.2, 1, 2, 4 mL置于10 mL容量瓶中，甲醇定容制刻度。按照2.1.1方法所示，分别测定所配白藜芦醇溶液的峰面积。以峰面积(A)和白藜芦醇质量浓度(C)进行线性回归，得到标准曲线：A=171089C-162.44，r=0.9998，表明白藜芦醇在1～200 mg/L范围内质量浓度与峰面积线性关系良好。

1.2.5 自微乳及稀释后微乳对白藜芦醇溶解度考察

分别称取自微乳SME 1-4各1 g，以及自微乳稀释不同倍数(10倍，20倍和100倍)所得微乳各1 mL装于1.5 mL Eppendorf 管中。将过量白藜芦醇加入到上述自微乳和稀释后微乳中，密封后置于全温震荡培养箱上(37 ℃，100 r/min)连续震荡72 h。将平衡后样品于8000 r/min转速下离心10 min，取上清液用甲醇稀释适当倍数，采用1.2.4所示方法测定白藜芦醇在上述自微乳和不同稀释倍数下所得微乳中的溶解度。

2 结 果

2.1 中链脂肪酸甘油酯作为油相

先按照1.2.1所示方法绘制了伪三元相图(如图1A)，在伪三元相图绘制过程中发现，随着水相加入，油/表面活性剂混合物首先形成W/O微乳，再形成凝胶态，最后当水相含量达到一定比例(>40%)时形成O/W微乳。当稀释倍数达到100倍，若MCT∶Smix比值低于或等于6∶4，得到均一、稳定、流动性好且带有淡蓝色乳光的微乳液。若MCT : Smix比值高于6∶4则形成乳白色不透明的乳液。我们分别考察了MCT∶Smix为0∶10，1∶9，2∶8, 3∶7，4∶6，5∶5，6∶4时稀释100倍后所得微乳的粒径(如图1B所示)，发现随着油相含量的增加微乳粒径从20 nm逐渐增大到140 nm，同时所得微乳液的多分散性低于0.4。

A:MCT为油相的伪三元相图；B:不同MCT含量时的微乳粒径和多分散系数图1 伪三元相图及不同MCT含量时的微乳粒径和多分散系数Fig 1 Pseudo-ternary phase diagram of MCT as oil phase and particle sizes and polydispersity indexes of microemulsions with different MCT

2.2 长链脂肪酸甘油酯作为油相

长链脂肪酸甘油酯蓖麻油和橄榄油均与Smix按照比例混合稀释后，肉眼观察发现，蓖麻油: Smix比值高于4∶6时，形成白色不透明乳液；低于或等于4∶6时，形成稳定、均一的微乳液。如图2A所示，蓖麻油微乳粒径在20～140 nm之间，且随蓖麻油含量增多而增大。相似的，橄榄油: Smix比值高于2∶8时，形成白色不透明乳液；低于或等于2∶7时，形成<60 nm的微乳液。当橄榄油含量达到30%时，形成350 nm的乳白色乳液(图2B)。相比中链脂肪酸甘油酯，长链脂肪酸甘油酯所得微乳粒径较大且分散性也较大。

2.3 非甘油三脂肪酸酯作为油相

非甘油三脂肪酸酯肉豆蔻酸异丙酯和油酸乙酯均与Smix按照比例混合并稀释后，肉眼观察发现，肉豆蔻酸异丙酯(或油酸乙酯) ∶Smix比值高于4∶6时，形成白色不透明乳液；低于或等于4∶6时，形成稳定、均一的微乳液。如图3所示，肉豆蔻酸异丙酯微乳和油酸乙酯微乳的粒径均在100 nm以内，并且随着肉豆蔻酸异丙酯和油酸乙酯含量增加，微乳粒径略有增大。

A:蓖麻油；B:橄榄油图2 不同油相含量时的微乳粒径和多分散系数Fig 2 Particle sizes and polydispersity indexes of microemulsions with different oil phase

A:肉豆蔻酸异丙酯；B:油酸乙酯图3 不同油相含量时的微乳粒径和多分散系数Fig 3 Particle sizes and polydispersity indexes of microemulsions with different oil phase

2.4 处方选择

通过比较上述微乳的粒径和多分散性系数，确定油相为MCT(40%和60%)，油酸乙酯(40%)和蓖麻油(40%)的自微乳处方，可以作为性质可比自微乳处方(处方组成见表1)。如图4A所示，40% MCT自微乳组和 40%油酸乙酯自微乳相比，所得微乳粒径大小和多分散性相近，具有可比性；而60% MCT自微乳和40%蓖麻油自微乳相比，所得微乳粒径大小和多分散性相近，具有可比性。此外，4组处方所得微乳的zeta电位均在-10～-7 mV之间(图4B)。

表1 4种自微乳处方的组成

A:粒径及多分散系数；B:Zeta电位图4 4种微乳的粒径、多分散系数和Zeta电位Fig 4 Particle sizes, polydispersity indexes and zeta potentials of four microemulsions

2.5 自微乳处方对白藜芦醇增溶能力考查

所选4种自微乳及其不同稀释倍数下(10倍，20倍和100倍)所得微乳对白藜芦醇溶解度与水溶解度的对比如图5所示。白藜芦醇在去离子水中的溶解度仅为10 μg/g，但是在自微乳中溶解度接近80 mg/g，为其水溶解度的8000倍。稀释后，所得微乳对白藜芦醇的增溶能力随着稀释倍数逐渐下降，即使稀释100倍后，白藜芦醇在微乳中溶解度依然比水溶解度高100倍以上。

图5 白藜芦醇在水、自微乳和稀释微乳中的溶解度Fig 5 Solubilities of resveratrol in water, SMEDDS and the diluted microemulsions

3 讨 论

近几十年，自微乳给药系统用来提高药物口服生物利用度越来越受到关注，研究自微乳口服后提高药物生物利用度的机制也日益深入。但是自微乳给药系统制备工艺的的角度如何设计出使药物高效吸收的自微乳处方依旧很困难[11-12]。目前，已有研究表明自微乳性质对药物口服生物利用度有显著性影响，包括微乳粒径大小、均一性、微乳稳定性以及油相/表面活性剂组成等。本实验目的在于制备一系列具有可比性的自微乳处方，通过制备一系列不同油相类型(中链脂肪酸甘油酯、长链脂肪酸甘油酯和非甘油三脂肪酸酯)的微乳液，从中筛选一系列性质可比自微乳处方：当油相类型相同时，所得微乳粒径及分散性差别较大；当油相类型不同时，所得微乳粒径及分散性相近。该性质可比自微乳处方可以分别单因素比较油相类型和粒径大小的影响。通过筛选确定4种自微乳处方，其中SME-2, SME-3和SME-4采用相同的油/表面活性剂/助表面活性剂比例，但油相种类分别为中链脂肪酸甘油酯、长链脂肪酸甘油酯和非甘油三脂肪酸酯；SME-1和SME-4粒径相近(约140 nm)而SME-2和SME-3粒径相近(约60 nm)。最后考察了所得4种自微乳对难溶性药物白藜芦醇的增溶能力，发现白藜芦醇在4种自微乳中的溶解度是水溶解度的近8000倍，稀释以后的微乳依然能很有效的提高白藜芦醇的溶解度。理论上，所得的4种自微乳处方能有效的提高白藜芦醇的生物利用度。通过比较4种自微乳处方载白藜芦醇的吸收情况，可以确定微乳油相类型和粒径大小对其提高药物生物利用度的具体影响。

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Preparation and selection of comparable self-microemulsifying drug delivery systems (SMEDDS) and their solubilizing capabilities on resveratrol

LIU Zhihao1, LYU Xia2, SONG Huiyi3, ZHANG Jianbin1

(1.CollegeofPharmacy，DalianMedicalUniversity，Dalian116044，China；2.CollegeofLifeScience，DalianNationalitiesUniversity，Dalian116600，China；3.KeyLaboratoryofIntegrativeMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China)

Objective To prepare and select comparable self-microemulsifying drug delivery system (SMEDDS) formulations with similar particle sizes，zeta potentials and polydispersity indexes and to detect their solubilizing capabilities on resveratrol. Methods We prepared a series of SMEDDS formulations composed of medium-chain triglycerides, long-chain triglycerides and non-triglycerides. Their particle sizes, polydispersity indexes and zeta potentials were studied by Zetasizer Nano ZS90, and selected the comparable SMEDDS formulations. The solubilizing capability of the selected SMEDDS formulations on resveratrol was detected by HPLC. Results The formulations containing 60% MCT or 40% castor oil as oil phase could form microemulsions of diameter 140 nm; while the formulations containing 40% MCT or 40% ethyl oleate could form microemulsions of diameter 60 nm. The solubilities of resveratrol in the four SMEDDS formulation were about 8000-fold of that in water. Conclusion If the compositions of SMEDDS were the same, the particle sizes and polydispersity indexes varied significantly, while if the composition of SMEDDS were different, the particle sizes and polydispersity indexes were similar. The obtained SMEDDS formulation could be applied to study the effect of SMEDDS properties on the drug bioavailability.

SMEDDS; resveratrol; solubilizing capability; particle size; polydispersity index

10.11724/jdmu.2017.02.03

国家自然科学基金青年基金项目(81603186)；辽宁省教育厅科学研究一般项目(L2016026)

刘志浩(1987-)，男，讲师。E-mail：liuzhihao12399@126.com

张建斌，讲师。E-mail：zhangjb@dmu.edu.cn

R944

A

1671-7295(2017)02-0116-05

刘志浩，吕侠，宋慧一，等.性质可比自微乳处方的制备、筛选及其对白藜芦醇增溶能力的研究[J].大连医科大学学报，2017,39(2)：116-120.

2016-12-27;

2017-03-17)