γ-干扰素释放实验在结核病诊断中的临床应用

张莺莺，周贝贝，王 晴

(1. 皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 检验科，安徽 芜湖 241001；2.皖南医学院 影像与检验学院，安徽 芜湖 241002)

·临床医学·

γ-干扰素释放实验在结核病诊断中的临床应用

张莺莺1，周贝贝2，王 晴2

(1. 皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 检验科，安徽 芜湖 241001；2.皖南医学院 影像与检验学院，安徽 芜湖 241002)

目的：探讨γ-干扰素释放实验在结核病诊断中的使用效能及A(ESAT 6)、B(CFP-10)两种抗原的差异分析。方法：选取2015年6月～2016年2月住院并明确诊断的患者476例为研究对象，通过结核感染T细胞斑点实验(T-SPOT.TB)检测患者外周血中结核致敏T细胞数量，分析该技术在结核病中的诊断效能，并比较A、B两种抗原的一致性。结果：T-SPOT.TB检测阳性率为47.1%(224/476例)、阴性率为52.9%(252/476)、灵敏度为78.1%、特异度为80.6%、阳性预测值为78.1%、阴性预测值为80.6%、阳性似然比为4.02、阴性似然比为0.27。T-SPOT.TB两种抗原A和B对不同患者的诊断无统计学差异(各组P值均>0.05)；总诊断效能一致性较好(Kappa>0.75)。结论：T-SPOT. TB检测对于结核病的诊断具有较高的灵敏度和特异度，且A、B两种抗原表现出不同的阳性检出规律和意义。T-SPOT. TB检测在结核分枝杆菌(MTB)感染的筛查、结核病快速早期辅助诊断和排除感染方面具有重要作用。

结核病； γ-干扰素释放； T-SPOT.TB； ESAT 6；CFP-10

【DOI】10.3969/j.issn.1002-0217.2017.02.006

结核病作为全球病死率最高的疾病之一，是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis, MTB)引起的慢性传染病，全球2012年约有860万例新发感染病例、130万例死亡病例。同时，约20亿潜伏感染者存在，使结核病例存在持续上升的风险而成为全球关注的焦点[1]。我国是结核病高负担国家之一，中国与印度结核感染人数占全球病例数近40%[2]。因此，建立早期、快速和准确的诊断是有效控制结核病的关键。目前我国临床诊断结核病的金标准为结核分枝杆菌培养，但由于培养时间较长(42～56 d)，难以满足临床需求[3]，其他辅助诊断实验如结核抗体(TB-Ab)测定、结核菌素皮肤实验(tuberculin skin test, TST)、结核特异性的核酸扩增检测(nucleic acid amplication tests，NAAT)等，常由于患者免疫功能低下导致实验假阴性、接种卡介苗引起假阳性、PCR方法技术要求高、无法区分死、活菌，且肺外结核病人存在取样困难等问题限制了其在临床的应用[2]。近年来，一种更敏感更特异的血液检测方法—— γ-干扰素释放实验(Interferon-γ release assays, IGRA)使用日益广泛。IGRA是采用结核分枝杆菌致敏的T淋巴细胞，再次受到相关抗原刺激后能迅速活化增殖并释放γ-干扰素(IFN-γ)的原理，通过检测IFN-γ对结核杆菌特异性抗原的免疫反应性，弥补了TST的不足[4]。IGRA实验平台包括酶联免疫斑点测定法(enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT)和酶联免疫吸附剂测定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)两种，在早期结核感染和潜伏性结核感染(latent tuberculosis infection, LTBI)的诊断中更具优势[5-6]。

作为ELISPOT法实验的一种，结核感染T细胞斑点实验(T-SPOT.TB)自2008年开始发展，即取5 mL外周血分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，利用ELISPOT法检测分泌干扰素的T淋巴细胞数量[7]。该方法通过定量检测全血在结核特异性抗原A(ESAT-6)和抗原B(CFP-10)刺激下释放的IFN-γ水平，从而诊断机体是否处于结核感染状态。本研究拟以T-SPOT.TB检测试剂盒对476例明确诊断的患者外周血进行结核感染T细胞的检测，将实验结果与A、B两种抗原刺激的结果进行比对分析，为下一步探讨定量检测γ-干扰素的释放对结核病诊疗中的意义奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 T-SPOT.TB试剂盒(Oxford Immunotec Ltd. 英国，牛津)；RPM1640细胞培养液(天津灏洋)；AIM-V培养液(天津美德)；人全血淋巴细胞分离液 (天津灏洋)；台盼蓝(上海复星)；PBS缓冲液(上海百赛)；生物安全柜(苏净安泰BHC-1300ⅡA2)；水平低速离心机(安徽中科中佳，KDC-2044)；CO2培养箱(三洋MCO-5AC)；生物显微镜(OLYMPUS CX22LED)；移液器(德国，Eppendorf)。实验耗材(15 mL离心管、5 mL移液管、1.5 mL EP管、10 uL/200 μL/1000 μL加样枪头等)全部高压灭菌、干燥后使用。

1.2 方法

1.2.1 研究对象 弋矶山医院2015年6月～2016年2月新入院且疑似结核病的患者521例，排除诊断不明的患者(临床既不能排除活动性结核病，亦不能诊断活动性结核病者)45例后，选择明确诊断的有效病例476例。根据患者的临床症状、痰或纤支镜灌洗液涂片抗酸染色、纤维支气管镜组织病理学检查、影像学表现、诊断性抗结核治疗的疗效等，将入选的患者划分为结核组与非结核组。分组标准如下：结核组① 临床诊断为活动性结核、同时T-SPOT.TB实验为阳性者。②临床诊断为活动性结核，而T-SPOT.TB实验为阴性者。确诊依据为有细菌学、病理学或影像学证据；临床上有结核病特征性表现；临床诊断结核病且抗结核治疗2周及以上有效。非结核组①临床诊断为非活动性结核、同时T-SPOT.TB实验为阴性者。②临床诊断为非活动性结核，而T-SPOT.TB实验为阳性者。

1.2.2 PBMC的分离 入组患者以肝素钠真空采血管抽取5～10 mL外周静脉血，与室温预热的RPMI 1640细胞培养液按1∶1比例混匀。按照稀释血样与淋巴细胞分离液2∶1的比例，把稀释血样轻轻加至4 mL淋巴细胞分离液上层。垂直放入水平离心机，18℃、1000 g离心22 min后，以无菌吸管吸取中间的白色、云雾层细胞(即PBMC)。吸取后进行两次洗涤：加1640细胞培养液至10 mL，600 g离心7 min，弃上清(管内留2～3 mL液体)，重悬细胞后，再次加培养液至10 mL，350 g离心7 min。弃干净上清，加400 μL AIM-V培养液重悬沉淀，即为PBMC细胞终溶液。

1.2.3 标准细胞液的配置 取10 μL细胞终溶液加到40 μL0.4%(w/v)台盼蓝染液中混匀，以改良牛-鲍计数板记录未着色的(活的)淋巴细胞，根据计数结果以AIM-V培养液稀释调整细胞浓度为2.5×106/mL，即为标准细胞液。

1.2.4 T-SPOT.TB实验及结果判读 根据试剂说明书，每份标本设置两个检测孔和两个质控对照孔。分别是：特异性抗原A检测孔(加入ESAT-6溶液50 μL)、特异性抗原B检测孔(加入CFP-10溶液50 μL)、阴性质控对照孔(加入AIM-V 50 μL)、阳性质控对照孔(加入PHA 50 μL)，每孔依次加入上述方法配置的标准细胞液100 μL。加样后将培养板放至5%CO2培养箱、37℃孵育16～20 h。第2天PBS洗板4次，每次加液后静置1 min后拍干。每孔加入酶标抗体50 μL(200倍稀释后)，置4℃冰箱孵育1 h。取出后同第一次PBS洗板步骤，拍干后每孔加入显色液50 μL，室温避光显色7 min，以蒸馏水终止反应，干燥后以4倍物镜显微镜或USB电子放大镜计数检测孔内结合在底膜上的特异性斑点数(表现为清晰的紫色斑点、中间色深、周围有浅色晕的点)。

结果判读： (1)判读为“有反应性”(阳性)，表明样本中存在特异的针对结核杆菌的效应T细胞。见于①阴性质控对照孔斑点计数为0～5个时且抗原A(或B)孔的斑点数减去阴性质控对照孔的斑点数后，数值≥6；②空白对照孔斑点数为6～10个时且抗原A(或B)孔的斑点数≥2倍阴性质控对照孔斑点数；(2)判读为“无反应性”(阴性)，表明样本中不存在特异的针对结核杆菌的效应T细胞，见于不符合(1)的标准且阳性质控对照孔正常(斑点数不少于20)。

1.3 统计学分析 以SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，灵敏度和特异度采用Fisher确切概率法，以P<0.05为差异有统计学意义。抗原A和抗原B诊断一致性采用配对卡方检验，当kappa≥0.75时，表明两者一致性较好；当0.75>kappa≥0.4时，表明一致性一般；当kappa<0.4时，表明两者一致性较差。

2 结果

2.1 研究病例基本信息 本文研究对象明确诊断者共476例，男293例，女183例，年龄3～96岁。确诊为活动性结核224例、排除活动性结核252例，所有患者均对T-SPOT.TB检测知情同意。

2.2 T-SPOT.TB结果与临床诊断符合情况 对疑似结核病患者行T-SPOT.TB检测，并结合临床最终确诊，将数据分为不同组别，见表1。所有检测质控结果均正常。分析T-SPOT.TB结果及抗原A(ESAT-6)、抗原B(CFP-10)，相关灵敏度(Se)、特异度(Sp)、阳性预测值(PPV)、阴性预测值(NPV)、阳性似然比(+LR)、阴性似然比(-LR)等见表2。数据提示，ESAT-6的灵敏度和阴性预测值高于CFP-10，较不易漏诊；CFP-10的特异性和阳性预测值高于ESAT-6，误诊率较低。

表1 各项检测结果与临床诊断符合情况

检测项目结核非结核合计T-SPOT.TB阳性17549224阴性49203252合计224252476ESAT-6阳性16142203阴性64209273合计225251476CFP-10阳性15335188阴性73215288合计226250476

表2 各检测方法的评价指标比较

评价指标T-SPOT.TBESAT-6CFP-10灵敏度(Se)/%78.171.667.7特异度(Sp)/%80.683.386.0阳性预测值(PPV)/%78.179.381.4阴性预测值(NPV)/%80.676.674.7阳性似然比(+LR)4.024.284.84阴性似然比(-LR)0.270.340.38

2.3 ESAT-6与CFP-10诊断效能一致性分析 结合临床诊断，对不同患者人群中两类抗原诊断效能一致性分析结果见表3。在224例确诊结核病患者人群、以及其他疾病患者252例人群的诊断中，ESAT-6与CFP-10两种抗原的差异均无统计学差异，P值均>0.05。此外，两个指标的检测一致性均较满意，对于不同人群的一致性均在中等以上(Kappa>0.4)，以总患者人群检测一致性最好(Kappa>0.75)。而在476例总患者人群中，两种抗原的配对卡方值为3.95，加之Kappa>0.75，P值接近0.05。相关指标见表4。

表3 不同组别患者两类抗原诊断效能一致性分析

ESAT-6CFP-10阳性数阴性数合计总患者组188288476 阳性16736203 阴性21252273结核患者组15272224 阳性13823161 阴性144963非结核患者组35217252 阳性281442 阴性7203210

表4 不同病种患者中两类抗原诊断的比较

患者总例数结核患者非结核患者P值0.0470.1880.191配对χ2值3.951.731.71Kappa0.7530.6080.679

3 讨论

活动性结核患者通过呼吸带菌飞沫可导致结核分枝杆菌的传播，约有10%的人群会在吸入后发展为活动性结核病(active tuberculosis, ATB)，且接触后前两年的发病风险最高[8]，免疫力低下的人群(包括HIV患者)则具有更高的活化风险[9]；剩余90%接触者因结核菌在体内处于休眠状态，成为无症状的潜伏性结核感染(latent tuberculosis infection, LTBI)[10]。我国作为结核病高发地区，无论对于活动性结核患者或潜伏感染者，快速诊断和早期治疗都是我国结核防治的重点[11]。目前的结核感染诊断方法包括结核菌培养、抗酸杆菌涂片、抗体测定、结核菌素皮肤实验(TST)、PCR检测DNA等均存在耗时长、阳性率低、假阳性高、临床诊断符合率低等问题。近十年间发展起来的γ-干扰素释放实验(Interferon-γ release assays，IGRA)通过检测γ-干扰素对结核杆菌特异性抗原的免疫反应性，具有更高的特异度和敏感性，在目前临床实践和诊断建议中，IGRA比TST更有优势[12-13]。T-SPOT.TB实验作为IGRA的一种，为结核病的快速、早期诊断提供了新途径。特别是肺外结核，由于缺乏特异的临床症状和指征，加之检测样本留取困难，阳性率低，一直是诊断的难点，而T-SPOT.TB利用外周血检测特异的免疫反应从而提示结核感染状态，为此类疾病提供了难得的辅助诊断指标。

国外数据显示T-SPOT.TB在诊断肺结核的综合灵敏度为0.75(95%CI: 0.69～0.81)、特异度为0.82(95%CI: 0.75～0.88)、PPV为0.85 (95%CI: 0.79～0.9)、NPV为0.7 (95%CI: 0.62～0.76)[14]。本研究中T-SPOT. TB对疑似结核病的诊断灵敏度为0.781、特异度为0.806、PPV为0.78、NPV为0.81，与国内文献报道范围相符[15]，但与国外报道有一定差异，主要表现为PPV偏低，而NPV较满意。造成这种差异的原因之一可能为该实验无法区分潜伏感染(LTBI)与活动性结核病，而我国人群LTBI的比例高于文中数据来源国家。我国2000年第四次全国结核病流行病学抽样调查结果表明，全年龄组结核菌素皮肤实验(TST)阳性率为44.5%(以硬结直径≥6 mm为标准)；基于QuantiFERON-TB Gold In-Tube(QFT)得出的总体感染率为18.8%[1]，该数据虽修正了过高的阳性率，但仍提示中国LTBI比例较高。对于LTBI而言，缺乏诊断的金标准，增大了排除结核感染的难度。基于T-SPOT.TB实验原理，LTBI者体内存在结核感染T细胞，因此本实验结果可为阳性。而参照WHO潜伏性结核管理指南[16]，在我国临床工作中，对于非高活化风险、且影像学检查无异常的LTBI者往往并不进行预防性治疗，亦不体现在临床诊断之中，因此这部分可能由LTBI引起的“假阳性”数据导致PPV数值偏低，提示临床医生应结合临床表现、接触史及其他检测方法，合理利用T-SPOT.TB的阳性结果辅助诊断。而本文NPV数据高于国外数据平均水平，证实了该指标的阴性结果能够提示临床医生优先考虑其他非结核性疾病。同时，作为筛查指标而言，其阴性结果更有意义。

本文进一步分析了两种抗原的诊断效能一致性。ESAT-6是结核诊断和新型结核疫苗研发中的主要靶蛋白，为BCG(卡介苗)在减毒传代过程中丢失的结核菌分泌性抗原[17]；而CFP-10属于ESAT-6家族，是1998年鉴定出来的低分子量蛋白，由lhp基因编码[18]。本研究结果显示在不同人群中，ESAT-6和CFP-10之间的灵敏度和特异度等指标比较中并未表现出统计学差异，这与蔺咏梅等研究一致[19]，但表2数据提示，ESAT-6的灵敏度和阴性预测值高于CFP-10，较不易漏诊；CFP-10的特异性和阳性预测值高于ESAT-6，误诊率较低。两种抗原之间的阳性率差异趋势在总患者人群中表现略为明显。对两种抗原一致性的研究发现，二者不仅对于阳性率的诊断无统计学差异，且诊断一致性较好(总患者人群检测配对卡方值3.95，Kappa>0.75)，对于不同疾病诊断的一致性表现出不同的结果，提示两种抗原对结果的判读存在不同的规律和特点。

另外，本实验技术也存在一定的不足之处。如ESAT-6和CFP10虽然在所有的BCG菌株、以及绝大多数环境分枝杆菌中缺失，但T-SPOT.TB的阳性结果有可能是堪萨斯、苏氏、戈登或海分枝杆菌的感染引起，应在临床诊断中加以甄别[20]；同时该实验可能受到年龄、免疫功能状态、体质量指数等因素的影响[21-22]，均提示应在今后的工作中通过扩大样本量、细化病种、比较影响因素的前提下进一步研究。

[1] GAO L, LU W, BAI L,etal. Latent tuberculosis infection in rural China: baseline results of a population-based, multicentre, prospective cohort study[J]. Lancet Infect Dis， 2015,15(3)：310-319.

[2] 田际云, 梅建, 高谦. 结核分枝杆菌潜伏感染的预防治疗及面临的问题[J]. 中华结核和呼吸杂志, 2016, 39(1):8-12．

[3] 苏俊华，梁桂亮，保凌，等． 昆明地区结核分枝杆菌标本培养检测及耐药情况分析[J]． 中国防痨杂志，2012，34( 1) : 32 - 35．

[4] ABUBAKAR I, STAGG HR, WHITWORTH H,etal. How should I interpret an interferon gamma release assay result for tuberculosis infection[J]?Thorax，2013, 68: 298-301.

[5] POLLOCK L, BASU ROY R, KAMPMANN B. How to use: interferon gamma release assays for tuberculosis[J]. Arch Dis Child Educ Pract Ed，2013, 98: 99-105.

[6] 吴思涵, 殷敏, 秦明明，等. 潜伏性结核感染的诊断进展[J]．国际检验医学杂志, 2015, 36(24): 3596-3599.

[7] LAVLANI A. Diagnosing tuberculosis infection in the 21st century: new tools to tackle an old enemy[J]. Chest，2007, 131: 1898-1906.

[8] MILLET JP, MORENO A, FINA L,etal. Factors that influence current tuberculosis epidemiology[J]. Eur Spine J，2013, 22(Suppl4): 539-548.

[9] GORDIN FM, MASUR H. Current approaches to tuberculosis in the United States[J]. JAMA，2012, 308: 283-289.

[10] BARKER RD. Clinical tuberculosis[J]. Medicine，2008, 36: 300-305.

[11] 唐神结, 肖和平. 新世纪我国结核病的新特点及防治策略[J]. 中国实用内科杂志，2011，31( 6) : 403 -405.

[12] WINTHROP KL. WEINBLATT ME, DALEY CL. You can′t always get what you want, but if you try sometimes (with two tests-TST and IGRA-for tuberculosis) you get what you need[J]. Ann Rheum Dis，2012, 71: 1757-1760.

[13] DIEL R, GOLETTI D, FERRARA G,etal. Interferon-release assays for the diagnosis of latent Mycobacterium tuberculosis infection: a systematic review and meta-analysis[J]. Eur Respir J，2011, 37: 88-99.

[14] ZHOU Q, CHEN YQ, QIN SM,etal. Diagnostic accuracy of T-cell interferon-g release assays in tuberculous pleurisy: A meta-analysis[J].Respirology，2011, 16(3): 473-480.

[15] WU X, HOU Y, LIANG Y,etal. Evaluation of a tuberculosis whole-blood interferon-gamma chemiluminescent immunoassay among Chinese military recruits[J]. Mol Diagn Ther, 2011, 15(6): 341-346.

[16] 裴宁, 卢水华. WHO《潜伏性结核感染管理指南》要点解析及我国研究现状[J]. 中国防痨杂志, 2015, 37(7):736-739.

[17] 李丽, 乔丹, 李琴, 等. 结核胸液中 ESAT - 6 多肽特异性多功能CD4 + T 细胞数量及功能分析[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2011, 27(1):26 - 28.

[18] 张丹, 朱中元, 王海波. 结核分枝杆菌CFP- 10蛋白的克隆及表达[J]. 中国热带医学, 2012,11(10): 1180- 1181.

[19] 蔺咏梅, 江自成, 皇甫彤, 等. T细胞斑点试验AB抗原检测结果对结核感染患者诊断意义探讨[J]. 临床和实验医学杂志, 2014, 20(13):1675-1678.

[20] PATEL VB, SINGH R, CONNOLLY C，etal. Cerebrospinal T cell responses aid the diagnosis of tuberculous meningitis in a HIV and TB endemic population[J]. Am J Respir Crit Care Med，2010，182: 569-577.

[21] JEON YL, NAM YS, YOU E,etal. Factors influencing discordantresults of the QuantiFERON-TB Gold In-tube test in patients with active TB[J]. J Infect, 2013, 67(4):288-293.

[22] HANG NT, LIEN LT, KOHAYASHI N,etal. Analysis of factors lowering sensitivity of interferon- gamma release assay for tuberculosis[J]. PLoS One, 2011, 6(8): e23806．

Clinical application of interferon-γ release assays in tuberculosis diagnosis

Zhang Yingying, Zhou Beibei, Wang Qing

Department of Clinical Laboratory, The first affiliated Hospital of Wannan Medical College，Wuhu 241001,China

Objective： To investigate the application value of interferon-γ release assays (IGRA) in tuberculosis diagnosis and tuberculosis infection diagnosis.Methods：Peripheral blood (PB) samples were collected from 476 cases of definite diagnosis patients(active tuberculosis or non-tuberculosis patients). A spot test using T lymphocytes infected with mycobacterium tuberculosis (T-SPOT.TB) was applied to detect the T lymphocytes in PB samples. The sensitivity and specificity for diagnosing tuberculosis by this method were evaluated.Results： T-SPOT.TB assay showed that the positive rate, negative rate, sensitivity, specificity, positive predictive value, negative predictive value, positive likelihood ratio and negative likelihood ratio were 47.1%,52.9%,78.1, 80.6%, 4.02 and 0.27, respectively．There was no statistical difference between antigens A and B on the positive rate of tuberculosis diagnosis(P>0.05), meanwhile T-SPOT.TB assay had good consistency(Kappa>0.75).Conclusion： T-SPOT. TB assay is favorable for the current diagnosis of tuberculosis as auxiliary diagnostic method.The two antigens A and B showed different patterns and significance of positive detection. This method could be better used for screening of tuberculosis, rapid diagnosis of tuberculosis, and large-scale clinical epidemiological investigation of tuberculosis.

Tuberculosis; Interferon-γ release; T-SPOT.TB; ESAT 6; CFP-10

1002-0217(2017)02-0221-05

国家自然科学基金青年基金项目(81301497)；安徽省自然科学基金青年基金项目(1408085QH148)

2016-11-25

张莺莺(1979-)，女，主管检验师，(电话)15395333867，(电子信箱)ying-micky@163.com。

R 521;R 392

A