小麦盐应答基因 TaSR1的生物信息学鉴定及表达验证

白子彧，丁 博， 李 杨，陈小强，李迎霞，杜亚军，郭 雨，谢晓东

(天津农学院农学与资源环境学院，天津 300384)

小麦盐应答基因 TaSR1的生物信息学鉴定及表达验证

白子彧，丁 博， 李 杨，陈小强，李迎霞，杜亚军，郭 雨，谢晓东

(天津农学院农学与资源环境学院，天津 300384)

为发掘小麦盐应答相关基因，利用Genevestigator在线生物信息学程序，分析了25个试验中118个样品的盐胁迫试验的转录组数据，筛选到2个盐应答候选基因。以中国春小麦为试验材料，将其三叶一心期幼苗根系置于200 mmol·L-1的NaCl溶液中，分别处理0、0.5、1、2、4和8 h，分析候选基因的表达模式。结果表明，其中1个候选基因的表达模式与生物信息学分析结果相近，受盐胁迫诱导明显上调表达，命名为 TaSR1。该基因编码区含有948个核苷酸，编码315个氨基酸。TaSR1蛋白含有KRTAP和PHA01732两个保守结构域，富含脯氨酸残基。

小麦；生物信息学；盐应答基因；表达验证

土壤盐渍化是影响世界作物分布和生产的重要环境胁迫因素之一，如今已侵蚀了全球约20%的灌溉土地，预计在21世纪中期，侵蚀的土地面积将会达到50%。中国大约有3.46×108hm2的盐渍化土地，占全球盐渍土壤面积的1/10，是全球占有盐渍土地面积最大的国家。小麦是我国重要的粮食作物，其生产状况直接关系国家的粮食安全。在当前耕地资源紧张的情况下，利用广阔的盐渍化土壤进行小麦种植，是保障小麦总产的一条重要途径[1]。但是土壤中高浓度的盐将会导致盐离子水平失衡，使小麦的生理生化功能发生紊乱，从而影响生长发育和品质[2-3]。而目前小麦耐盐种质资源相对匮乏，采用常规育种方法改良小麦耐盐性面临诸多困难，所以有必要鉴定小麦耐盐相关基因，进行分子育种研究。

目前，在小麦中已克隆出许多与盐应答相关的基因，例如与植物渗透调节机制相关的小麦V型质子泵基因[8]、小麦糖原合成酶激酶基因[9]以及小麦ERF转录因子基因[10]等，这些研究主要采用同源克隆的方法，而这种方法通常难以发现新的耐盐机制。生物信息学的出现大大推动了分子生物学的发展[5]。从转录组学的角度鉴定耐盐相关基因不失为一种更加方便有效的工具和手段。本研究拟采用生物信息学和分子生物学相结合的方法，分析在线数据库中的盐胁迫试验的转录组数据，筛选基因探针，并对生物信息学的分析结果进行表达验证，以期得到小麦盐胁迫应答相关基因，用于小麦耐盐性状的遗传改良。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为中国春小麦种子，由天津农学院天津-布里斯托环境变化对农作物影响研究中心提供。

1.2 盐应答候选基因的筛选

利用Genevestigator(https://genevestigator.com/gv/s)在线生物信息学程序，检索出25个试验中118个样品的盐胁迫试验的转录组数据，并对其进行分析，选取在盐胁迫后表达量显著升高的Affymetrix探针，分析探针中的开放阅读框，再进行不同物种中同源基因的检索，除去没有同源基因的探针，最终得到盐应答相关的候选探针。

1.3 盐胁迫处理

选取籽粒饱满、大小均匀一致的中国春小麦种子，用70%乙醇溶液消毒2 min，然后用蒸馏水冲洗干净，用Hoagland培养液温室培养至三叶一心期，从培养皿中取出，分别放在6个培养瓶中，加入200 mmol·L-1的NaCl溶液，使幼苗的根全部浸没在溶液中，分别浸泡0、0.5、1、2、4和8 h后剪取幼苗根部，液氮速冻，-80 ℃保存。试验设置3次重复。

1.4 总RNA的提取及反转录

总RNA的提取依据TIANGEN公司的RNA prep pure植物总RNA快速提取试剂盒说明书进行。经过1%的琼脂糖胶电泳检测确认RNA质量。参照Thermo反转录试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA，于-20 ℃保存，备用。

1.5 TaSR1基因的表达分析

Affymetrix探针全部根据小麦转录本序列设计，其中含有编码区序列。利用NCBI Primer Blast在线程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)，对1.2中得到的盐应答候选探针中的编码区序列进行特异性RT-PCR引物设计(表1)。以1.4中反转录得到的不同处理的cDNA为模板，以小麦β-actin基因(表1)为内参，进行PCR扩增。反应体系为20 μL，包括cDNA模板1～2 μL(根据内参基因β-actin的扩增情况，决定不同处理材料的cDNA模板量)、正反引物(10 μmol·L-1)各1 μL、Phusion Buffer 4 μL、dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1) 0.4 μL、Phusion DNA聚合酶0.2 μL，其余用ddH2O补足。反应程序：98 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，25(β-actin)/45(探针Ta.13938对应的基因)/37(探针Ta.40261对应的基因)个循环；72 ℃延伸10 min。

1.6 序列分析

利用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)对基因开放阅读框进行分析。利用Geneious软件(http://www.geneious.com/)对基因的核苷酸和蛋白质序列进行分析。利用NCBI的CDD(Conserved Domain Database)数据库对基因编码蛋白进行保守结构域预测。

表1 RT-PCR分析所用引物

Table 1 Primers for RT-PCR

探针/基因 Probe/Gene引物序列 Primersequence片段大小 Fragmentsize/bpTa．40261F：5′⁃CCAACAACGGCACATCCC⁃3′513R：5′⁃TCCGTTGGGTTCTCTGAAGATGG⁃3′Ta．13938F：5′⁃GACAGTGAGTCCAATGGCGT⁃3′721R：5′⁃ACTGGCGTAGAGGGAAAGAACA⁃3′β⁃actinF：5′⁃CAGATGATCCTAGCCTCGCC⁃3′400R：5′⁃CCAAAGGCTAATCGGGAGAAA⁃3′

2 结果与分析

2.1 盐应答基因筛选结果

采用Genvestigator在线分析程序，对25个试验中118个样品的盐胁迫试验的转录组数据进行分析，结果(图1)发现，探针Ta.13938和Ta.40261对应的基因在盐诱导后表达量显著提高(P=0.001)，且在数据库中可检索到不同物种中存在同源基因，说明这2个探针对应的基因可作为盐应答候选基因进行深入分析。

所有数据在Genevestigator中经过归一化处理，图中数值为平均值±标准误，标准误用误差棒表示出来，误差棒上数字为样品数；**表示处理组与对照组在0.01水平上差异显著。

All data were normalized on the Genevestigator platform and are presented as mean±SEM,with sample size marked above the error bars；** indicated significant difference atP<0.01 byT-test.

图1 生物信息学分析探针Ta.13938和Ta.40261对应基因在盐处理后的相对表达量

Fig.1 Bioinformatic analysis of relative expression levels of genes corresponding to probe Ta.13938 and Ta.40261 under salt treatments

2.2 候选基因的RT-PCR分析

为了对生物信息学预测的结果进行验证，利用RT-PCR法对经盐处理不同时间的小麦中盐应答候选基因的表达水平进行检测，结果(图2)显示，探针Ta.13938对应的基因在处理0、0.5和1 h时表达量接近，在处理2和4 h时表达量较高，8 h时略有下降，但仍高于0 h时的表达量，与生物信息学分析的结果相近；而探针Ta.40261对应的基因在0 h时表达量较高，但处理之后的表达量出现下降的趋势，与生物信息学分析的结果不同。试验验证结果表明，探针Ta.13938对应的基因受盐胁迫诱导表达，说明其为盐应答基因，故暂命名为 TaSR1( Salt Responsive Gene 1)。

图2 小麦经盐处理后探针Ta.13938和Ta.40261对应基因的表达模式

2.3 TaSR1基因及其编码蛋白的序列分析

利用ORF Finder对 TaSR1基因序列进行分析，结果(图3)显示， TaSR1基因ORF全长948 bp，编码315个氨基酸。利用CDD对 TaSR1基因推导的氨基酸序列进行分析，结果(图4)显示，TaSR1蛋白含有2个蛋白家族的保守结构域KRTAP和PHA01732。

图3 TaSR1基因的ORF及蛋白质序列

图4 TaSR1蛋白的保守结构域

3 讨 论

本研究利用Genevestigator转录组分析工具和NCBI上的一些生物信息学程序对小麦盐应答候选基因进行筛选，然后通过RT-PCR方法进行验证。结果发现， TaSR1基因的RT-PCR分析结果与生物信息学预测结果相吻合，为盐胁迫诱导基因；而探针Ta.40261对应基因的RT-PCR分析结果与生物信息学预测结果不一致，因而对生物信息学分析结果进行实验验证非常必要。序列分析表明， TaSR1基因编码蛋白序列中含有 KRTAP角蛋白家族的保守结构域，该蛋白家族主要存在于哺乳类动物毛发和上皮细胞中，与干旱和严寒环境下基因调控和信号转导相关[30]。有研究发现，植物细胞中也存在类似动物细胞的角蛋白纤维体系[31]，在拟南芥细胞质中有类角蛋白的中间纤维，能够在盐溶液处理时，保持细胞的稳定性[32]。 TaSR1基因编码蛋白序列中还有PHA01732蛋白家族保守结构域，该家族成员富含脯氨酸(PRP)。PRP是植物细胞壁的结构蛋白，在小麦[33]、水稻[34]、棉花[35]和芝麻[36]等物种中已克隆出其蛋白家族的基因。现有研究表明，PHA01732蛋白家族成员与植物抗病、响应激素和非生物逆境胁迫等性状有关。综上所述，采用生物信息学的方法及试验验证，本研究鉴定了一个新的小麦盐应答基因 TaSR1，通过后续深入研究，有望解析其参与小麦盐应答反应的机制及功效。

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Bioinformatic Screening and Expression Validation of Salt Responsive Gene TaSR1 in Wheat

BAI Ziyu,DING Bo,LI Yang,CHEN Xiaoqiang,LI Yingxia,DU Yajun,GUO Yu,XIE Xiaodong

(College of Agriculture and Environmental Resources,Tianjin Agricultural University,Tianjin 300384,China)

To explore salt-responsive genes in wheat for the genetic improvement of salt tolerance traits,we analyzed the transcriptomic data of 118 samples under salt stress treatments using Genevestigator online platform and two genes were selected as candidate genes for further validation. Roots of Chinese Spring(TriticumaestivumL.) were placed in 200 mmol·L-1NaCl solution for 0,0.5,1,2,4 and 8 h,and then sampled for RT-PCR. The results showed that one of the genes demonstrated the similar gene expression pattern as predicted by bioinformatic analysis and was significantly induced and upregulated by salt stress,which is designated as TaSR1 gene(Salt Responsive Gene 1). The coding region of TaSR1 contains 948 nucleotides encoding 315 amino acids with two conserved domains,KRTAP and PHA01732,which are proline-rich.

Wheat; Bioinformatics; Salt-responsive gene; Expression validation

时间：2017-03-07

2016-04-29

2017-01-13

国家大学生创新创业训练计划项目(201410061004，201510061047)；天津市131创新型人才团队计划项目；天津市高校学科领军人才培养计划项目

E-mail:baiziyu1990@163.com(白子彧)；yuancircle@126.com(丁 博，与第一作者同等贡献)

谢晓东(E-mail:xiex@tjau.edu.cn)

S512.1；S330

A

1009-1041(2017)03-0307-05

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170307.1637.012.html