伊斯帕汗小麦 NAM-B1基因序列与蛋白质含量变异的分析

胡喜贵,伍碧华

(1.四川农业大学小麦研究所，四川成都 611130; 2.河南科技学院小麦中心，河南新乡 453003)

伊斯帕汗小麦 NAM-B1基因序列与蛋白质含量变异的分析

胡喜贵1,2,伍碧华1

(1.四川农业大学小麦研究所，四川成都 611130; 2.河南科技学院小麦中心，河南新乡 453003)

野生二粒小麦(TriticumdicoccoidesKörn.,AABB,2n=4x=28) NAM-B1基因的表达可以加速植株衰老，促进叶片营养向籽粒转移，提高籽粒蛋白质、铁、锌等物质含量。本研究采用同源克隆方法从6份伊斯帕汗小麦(T.ispahanicumHeslot,AABB,2n=4x=28)中克隆得到5个 NAM-B1基因。它们具有典型的NAM基因核苷酸结构特点，均含有3个外显子和2个内含子。与已报道的 NAM-B1基因比对分析发现，居群PI330548中的 NAM-B1基因因核苷酸序列上第11位点T的插入而引起移码突变，具有无功能型基因的结构特征，其他4个则具有功能类型基因的结构特征。4个功能类型 NAM-B1基因的推导氨基酸序列一致性高达99.7%，它们之间仅有5个氨基酸的变异。供试的6份伊斯帕汗小麦之间籽粒蛋白质含量(GPC)存在显著差异。与高GPC材料PI346782相比，低GPC材料PI572904的 NAM-B1基因编码氨基酸序列中存在2个位点的变异，分别为NAC域内的C亚区第88位Q→R和TAR区域第364位P→R的替换。推测伊斯帕汗小麦GPC的变异与其 NAM-B1基因的这些突变存在一定关系。

伊斯帕汗小麦； NAM-B1基因；籽粒蛋白质含量

植物转录因子是功能基因组研究的一个重要方面。在模式植物拟南芥基因组中，超过5%的基因为转录因子[1]。转录因子通过调控下游基因的表达而成为调节各种生理活动的关键环节。NAC转录因子在改良作物品质中有重要作用，已成为当前植物基因功能及表达网络调控研究的热点[2]。随着对NAC基因的广泛研究，近年来在小麦中发现了GRAB[3]、NAM[4]、TaNAC[5-6]等基因。小麦6B染色体上一个数量性状位点(QTL)被发现与籽粒蛋白质含量(GPC)有关，将其命名为 NAM-B1[4,7]。 NAM-B1基因广泛地表达于野生二粒小麦(T.dicoccoides)和驯化的栽培二粒小麦(T.dicocconSchrank,AABB,2n=4x=28)中，却沉默于硬粒小麦(T.durumDesf.,AABB,2n=4x=28)和六倍体普通小麦中(T.aestivumL.,AABBDD,2n=6x=42)[4]。这个基因的沉默归因于其编码区中1 bp的插入所导致的移码突变[4,8]。由于 NAM-B1基因被视为驯化基因之一，影响小麦的籽粒蛋白质含量，因而其越来越引起了当代育种者进行研究的兴趣[8-9]。迄今，在二粒系小麦中，除了野生二粒小麦和栽培二粒小麦有 NAM-B1基因的报道外，其他二粒系物种的 NAM-B1还未见报道。

伊斯帕汗小麦(T.ispahanicum，AABB,2n=4x=28)是二粒系小麦中的原始种之一，分布狭窄，仅有单芒和双芒2个变种[10]。该种小麦的特点突出。其幼苗直立，分蘖较少，叶片茸毛稀长；株高90～100 cm，茎较弱，茎节有短毛；穗长9～10 cm，侧面宽于正面，每小穗结实2粒；护颖、外颖和内颖均为长披针形，护颖长达1.2～1.5 cm，宽0.1 cm以下，内颖比外颖短1/4～1/3；穗轴较细易断，断穗方式为上节位；因籽粒带皮，难脱粒；粒长形，红色，硬质，春性；种子休眠期短，收获前易在穗上发芽；籽粒蛋白质含量较高；抗叶锈病、秆锈病和散黑穗病，感条锈病和白粉病。

本研究对伊斯帕汗小麦(T.ispahanicum) NAM-B1基因编码区进行克隆，并分析其序列结构特征；探讨伊斯帕汉小麦的 NAM-B1变异位点与GPC的关系，以期进一步深入认识功能型 NAM-B1基因的结构特点，进而为现代普通小麦品质改良提供重要的基因资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验选用的6份伊斯帕汗小麦材料(T.ispahanicum)，均由美国种质资源库(NPGS)馈赠(http://www.ars-grin.gov)，其中，1份(PI294478)来自法国，1份(PI330548)来自英国，1份(PI346782)来自匈牙利，3份(PI352492、PI572904和PI352493)来自伊朗。所有材料均种植于成都温江四川农业大学小麦研究所试验田。

1.2 NAM-B1基因扩增和测序

按照Yan等[11]的2×CTAB方法，从6份伊斯帕汗小麦的幼嫩叶片中提取其基因组DNA。根据Uauy等[4]报道的野生二粒小麦(T.dicoccoides)的 NAM-B1基因(DQ871219)序列，设计一对扩增NAM基因全序列的引物P1和P2。 P1序列：AGATCTGATGAGGTCCATGGG；P2序列：ATGCCCGTATGTGGTGTTCATAT。采用高保真ExTaq酶(TaKaRa,大连,中国)进行PCR扩增。其反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 50 s，65 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。扩增产物用1.0%琼脂糖进行电泳分离，切取目的条带，并用PUEX Gel DNA 回收试剂盒(Bioche，北京，中国)纯化。将目的片段连接到载体pMD-19T上，经转化筛选阳性，送商业公司(BGI，深圳，中国) 测序。克隆和测序均被重复至少3次，以消除误差。

1.3 成熟籽粒GPC测定

参考Pettersson和Eckersten[12]的方法，采用近红外仪(Infratec○R1241 Grain Analyzer，FOSS,Denmark)测定成熟籽粒中的蛋白质含量。每个样品重复三次。

1.4 数据分析

利用DNAMAN(ver. 6.0.3.48)软件对 NAM-B1核苷酸和氨基酸序列进行比较分析。利用SAS软件(JMP ver. 9.1，Cary,NC,USA)对籽粒蛋白质含量进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 NAM-B1基因克隆结果

利用引物P1和P2对6份伊斯帕汗小麦的基因组DNA进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳，1份材料(PI352493)未有扩增产物，其余5份材料(PI294478、PI330548、PI346782、PI352492、PI572904)均扩增出大约1 500 bp的目的条带(图1)。将其目的条带回收、纯化后连接到pMD19-T载体上，经测序分析，有4份材料的条带核苷酸序列长1 541 bp，1份材料为1 543 bp，它们对应GenBank数据库编号为KC344395～ KC344399(表1)。

2.2 NAM-B1基因的核苷酸序列特点

利用DNAMAN软件，进行序列多重比对。结果表明，伊斯帕汗小麦5个 NAM-B1基因的核苷酸序列与前人在硬粒小麦和野生二粒小麦中报道的 NAM-B1基因具相似长度，均含有3个外显子区域和2个内含子区域，其一致性达99.7%(图2)。

泳道M：DNA 标记；泳道1、2、3、4、5 和6 分别为PI294478、PI330548、PI346782、PI352492、PI352493(无扩增产物)和PI572904。

Lane M：DNA ladder; Lane 1,2,3,4,5 and 6 are PI294478,PI330548,PI346782,PI352492,PI352493(no amplification products) and PI572904,respectively.

图1 PCR扩增伊斯帕汗小麦中 NAM-B1基因的电泳图

Fig.1 PCR amplifications of NAM-B1 gene fromT.ispahanicum

表1 二粒系小麦中已报道的和本研究的 NAM-B1基因

Table 1 NAM-B1 genes from this study and previous reports in emmer wheats

基因登录号GenBankNo．长度Length/bp物种(材料)Species(accessions)参考文献ReferenceDQ869674∗1543T．durumUauy，etal[4]DQ8696731542T．dicoccoidesUauy，etal[4]DQ8712191542T．dicoccoidesUauy，etal[4]KC3443951541T．ispahanicum(PI294478)KC3443961543T．ispahanicum(PI330548)KC3443971541T．ispahanicum(PI346782)KC3443981541T．ispahanicum(PI352492)KC3443991541T．ispahanicum(PI572904)

*：无功能的NAC转录因子。

*：Nonfunctional NAC transcription factor.

伊斯帕汗小麦材料PI330548中 NAM-B1基因与硬粒小麦中DQ869674的核苷酸序列具有一致的长度，均为1 543 bp，它们之间仅有3个突变位点，分别是第368位的T→C、第873位的A→G和第1 509位的C→T。已报道的DQ869674基因是失活型的，主要原因是在编码区中第11位出现T碱基插入，导致移码突变。可见，PI330548中的 NAM-B1也属无功能类型的基因。伊斯帕汗小麦材料PI294478、PI346782、PI352492和PI572904的 NAM-B1与已报道野生二粒小麦中具有功能性的DQ821219和DQ869673高度一致，其最主要的差异是在外显子区域的第714位存在C→G的颠换和内含子区域的第891位缺失一个C碱基。该结果表明这4个伊斯帕汗小麦材料的 NAM-B1基因具有功能类型的结构特征。

对伊斯帕汗小麦材料中4个表达型 NAM-B1基因的核苷酸序列比较分析发现，共存在9个突变位点。其中，PI294478中有3个位点，分别是第931位的C→T、第1 059位的A→G和第1 170位的G→A发生了转换；PI346782、PI352492和PI572904中均具有2个突变位点，6个位点中，PI572904的第1 416位发生了C→G的颠换，其余5个位点均为转换。可见，伊斯帕汗小麦的 NAM-B1基因是相对保守的。

Double biases(//) or dashes(-) indicate identical sequences; Dot(.) is deletion;Solid and hollow rectangular indicate extron and intron,respectively; Solid arrows indicates T insertion at position 11 leads to reading frame shift resulting in NAM-B1 gene inactivation; Hollow arrows are mutation positions.

图2 伊斯帕汗小麦与已报道的 NAM-B1基因核苷酸序列的比较分析

Fig.2 Comparison of the nucleotide sequences of NAM-B1 genes fromT.ispahanicumand previously published tetraploid wheats

2.3 NAM-B1基因的氨基酸序列特点

对根据伊斯帕汗小麦与野生二粒小麦的功能类型 NAM-B1基因推导的NAC蛋白氨基酸序列进行比较发现，它们具有相同的氨基酸序列长度，均具有407个氨基酸，并具有相似的结构特征，均含有5个亚区A、B、C、D和E的N-端NAC区域和C-端转录活性区域(TAR)(图3)。仅有5个氨基酸变异位点，2个位于N-端NAC区域，3个位于C-端转录活性区域(TAR)。

4个伊斯帕汗小麦的 NAM-B1基因编码的NAC序列中，PI346782最为保守，没有任何氨基酸变化。PI352492有1个变异位点，即位于第30位的S→P替换，是由核苷酸位点89处的T→C转换所致。PI294478和PI572904均有2个变异位点，其中前者分别为第245位的H→R和第282位的S→N替换，它们分别由核苷酸位点1059的A→G和位点1170的G→A所致；而后者发生了第88位的Q→R和第364位的P→R替换，是分别由核苷酸位点479的A→G转换和位点1416的C→G颠换所引起(图2，图3)。

2.4 伊斯帕汗小麦的籽粒蛋白质含量差异

6份伊斯帕汗小麦的籽粒蛋白质含量存在极显著差异(F=163.22，P<0.01)。其中，3份材料PI294478、PI346782和PI352492的籽粒蛋白质含量大于16.00%，并显著高于其余3份材料(PI572904、PI330548和PI352493)的籽粒蛋白质含量(表2)。

3 讨 论

前人报道了野生二粒小麦和栽培二粒小麦广泛存在 NAM-B1基因，而在硬粒小麦和六倍体的普通小麦中 NAM-B1基因因单碱基插入的移码突变导致没有功能，或在驯化过程中被删除了[4,8]。本研究发现，6份伊斯帕汉小麦中，有1份材料(PI352493)没有扩增出目的基因，可能是其 NAM-B1基因因驯化被删除了。另5份材料扩增出了目的基因，其中PI330548中的 NAM-B1基因与硬粒小麦 NAM-B1基因(DQ869674)均在其核苷酸序列第11位处发生了碱基T的插入，致使其成为无功能型；而其余4份材料中的 NAM-B1基因，与野生二粒小麦功能性 NAM-B1基因(DQ871219和DQ869673)具有较高相似性，均具有功能类型的序列结构特征(图2)。

NAC domain表示N-端NAC区域，A～E分别表示NAC的5个亚区域；TAR(transcriptional activation region)表示C-端转录活性区域。粗体字母显示变化的氨基酸。

NAC domain indicates the N-terminal NAC domain; A-E indicate the five NAC sub-domains. TAR is the C-terminal transcriptional activation region; Bold-type letters are variation of amino acids.

图3 伊斯帕汗小麦的与已发表的野生二粒小麦的功能类型 NAM-B1基因的推导氨基酸序列比较分析

Fig.3 Comparison of the deduced amino acid sequences of the functional type NAM-B1 genes fromT.ispahanicumand previously publishedT.dicoccoides

表2 6份伊斯帕汗小麦的籽粒蛋白质含量(GPC)

Table 2 Variations of grain protein content (GPC) inT.ispahanicum

已有研究报道，具有功能的 NAM-B1基因促进营养物质从营养性组织中外送至籽粒，而使籽粒中的营养物质含量得以提高[4，9，13]。而无功能的 NAM-B1(如硬粒小麦中的DQ869674)被认为与现代普通小麦品种的低籽粒蛋白质含量有关。这种观点也得到其他学者研究的支持[14-17]。本研究中，6份伊斯帕汗小麦的籽粒蛋白质含量显著不同，其变化范围为13.70%～17.03%(表2)。其中，PI294478、PI346782和PI352492的籽粒蛋白质含量大于16.00%，它们的 NAM-B1基因均具有功能型的结构特征(图3)。其余3份材料的籽粒蛋白质含量相对较低，其中，PI352493中的 NAM-B1基因可能被删除了，PI330548中的 NAM-B1基因属于无功能型的结构，PI572904则含有功能类型的 NAM-B1基因。通过比较低籽粒蛋白质含量的PI572904与高籽粒蛋白质含量的PI346782之间的 NAM-B1基因编码的氨基酸序列发现，有2个位点发生了氨基酸的变异，除位于NAC区域亚区C中第88位的Q→R是由核苷酸位点479的A→G转换引起氨基酸替换外，还在TAR区域第364位因碱基颠换(核苷酸位点1 416，C→G)发生了氨基酸替换(P→R)。对大麦和小麦NAM基因的有关研究均表明其氨基酸的变化影响籽粒蛋白质含量的变异[15-17]，该研究结果在一定程度上暗示了 NAM-B1基因中该2个位点突变与高籽粒蛋白质含量可能存在一定关系；同时，也暗示了伊斯帕汗小麦中可能存在高蛋白质含量的遗传资源，但尚需进一步研究证实。

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Variations of NAM-B1 Gene and Grain Protein Content inTriticumispahanicumHeslot

HU Xigui1,2,WU Bihua1

(1.Triticeae Research Institute,Sichuan Agricultural University,Chengdu,Sichuan 611130,China;2.Center of Wheat Research,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang,Henan 453003,China)

The NAM-B1 gene inT.dicoccoidesis able to accelerate senescence and increase nutrient remobilization from leaves to developing grains,resulting in improving the grain protein content(GPC) and iron and zinc contents. In this study,five NAM-B1 genes were cloned from sixT.ispahanicumaccessions using homologous cloning method,which have typicalNAMgene nucleotide structure characteristics with three exons and two introns. Compared with previously reported NAM-B1 gene,the base T insertion at the position 11 occurred in the NAM-B1 gene of PI330548,which lead to frame shift mutation,implying it being non-functional while others functional. The deduced amino acid sequences of the four functional NAM-B1 genes had a high identity for 99.7% with only five amino acids variation. The grain protein contents(GPCs) were significantly different among the six tested accessions. In comparison with amino acid sequence of accession PI346782 with high GPC,that of PI572904 with low GPC existed two substitutions of amino acid including the Q→R at locus 88 in sub-domain of NAC domain and the P→R at locus 364 of TAR region,although they all had functional NAM-B1 gene. The results implied that the mutations of NAM-B1 gene may be associated with GPC variation ofT.ispahanicum.

Triticumispahanicum; NAM-B1 gene; Grain protein content

时间：2017-03-07

2016-09-30

2016-10-23

教育部高等学校博士学科点专项科研基金(博导类)项目(20125103110003)；四川省科技厅国际合作项目(2015HH0021)；河南科技学院引进高层次人才科研启动项目(201010613001)

E-mail：xiguihu@126.com

伍碧华(E-mail:wubihua2005@126.com)

S512.1；S330

A

1009-1041(2017)03-0295-06

网络出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170307.1637.006.html