CBX8过表达或沉默对人神经胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

张百平， 孙树凯， 贾 栋

(第四军医大学唐都医院神经外科，陕西 西安 710038)

CBX8过表达或沉默对人神经胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响

张百平， 孙树凯， 贾 栋△

(第四军医大学唐都医院神经外科，陕西 西安 710038)

目的： 探究染色质结构域蛋白8(chromodomain protein 8，CBX8)对人神经胶质瘤细胞增殖与凋亡的作用。方法: Western blot和RT-qPCR检测组织及细胞系中CBX8的表达。构建过表达CBX8和沉默CBX8载体，转染神经胶质瘤细胞T98G和U87MG，分别用MTT法和BrdU实验检测细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡。结果: 与正常脑组织和星形胶质细胞相比，神经胶质瘤组织及细胞中的CBX8蛋白和mRNA水平明显上升。在T98G和U87MG细胞中，过表达CBX8均促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，并上调Rb/E2F1的表达水平，而沉默CBX8则作用相反。sh-E2F1转染细胞之后，cyclin D1的表达以及Bcl-2/Bax的比值降低。结论: CBX8可能通过Rb/E2F1通路调节胶质瘤细胞的增殖和凋亡。

神经胶质瘤； 色素框同源物8； T98G细胞； U87MG细胞

神经胶质瘤亦称胶质细胞瘤，是最常见的颅内肿瘤，因其较高的致死率成为众所周知的恶性肿瘤[1-2]。目前临床上以手术治疗为主，辅以放疗及化疗等综合治疗，但是由于胶质瘤的恶性程度高，呈浸润性生长，与周围正常脑组织无明显分界，因此，手术治疗的效果并不理想。近年来，越来越多的人开始研究胶质瘤发生发展中的分子生物学机制，致力于为胶质瘤的诊断和治疗寻找新的途径[3-4]。染色质结构域蛋白8(chromodomain protein 8，CBX8)，是多梳基因抑制复合物1(polycomb repressive complex 1，PRC1)的成员之一[5]，它的异常表达与癌细胞的增殖和迁移密切相关[6]。最近的研究表明，CBX8在神经胶质瘤组织中高表达[7]，但其是否促进胶质瘤细胞的增殖及其相关机制尚无明确报道。因此，本文通过构建CBX8过表达和沉默载体，检测其对胶质瘤细胞增殖、凋亡和p-Rb/E2F1表达等的影响，旨在探究CBX8表达对神经胶质瘤细胞增殖凋亡的影响及其相关机制。

材 料 和 方 法

1 材料

人正常脑组织(20例)和胶质瘤组织(24例)均由唐都医院神经外科提供；人胶质母细胞瘤细胞系U87MG和T98G，以及HEK293T细胞均来源于ATCC；人胎脑星形胶质细胞(Cell Applications Inc.)；DMEM高糖培养基、双抗(含5×104U/L青霉素和50 mg/L链霉素)和胎牛血清(Gemini)；MTT、二甲基亚砜(DMSO)和LipofectamineTM2000 脂质体转染试剂盒(Invitrogeo);兔抗人CBX8、p-Rb、E2F1、cyclin D1、Bcl-2和Bax多克隆抗体，鼠抗人β-actin单克隆抗体(Abcam)；羊抗鼠HRP标记的II抗、ECL显色试剂盒和BCA试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

2 实验方法

2.1 组织样本采集 标本采集时先切成小块，然后迅速置于冻存管中在-80 ℃下保存。其中，正常脑组织均为内减压切除的标本，胶质瘤病例均经组织病理学检查证实为胶质瘤，并按WHO神经系统肿瘤分类标准确定病理诊断和分级[8]。所有组织采集前均得到病人及其家属的知情同意，并通过唐都医院医学伦理学委员会批准。

2.2 细胞培养 HEK293T细胞、人胶质母细胞瘤细胞系U87MG和T98G采用含10%胎牛血清和双抗的DMEM高糖培养基培养，人胎脑星形胶质细胞采用星形胶质细胞生长培养基，在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。

2.3 载体的构建 参照文献方法[9]完成，以健康人脑组织总RNA为模板，采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法获得CBX8的cDNA，并与Flag标记的pcDNA3和pEGFP-C3载体连接，构建Flag-CBX8表达载体，测序鉴定正确后中量制备待用。

CBX8和E2F1重组腺病毒用pAdEasy系统构建[5]，将Flag标记的CBX8和E2F1亚克隆至pAdTrack-CMV质粒上，再与pAdEasy腺病毒骨架质粒重组，得到重组腺病毒载体，再转染至HEK293T细胞进行扩增与纯化。利用Adeno-X快速滴度试剂盒(Clontech)测定病毒滴度。CBX8和E2F1 shRNA病毒滴度均为5×1011TU/L。

2.4 细胞转染 取对数生长期的U87MG细胞和T98G细胞以5×105/cm2接种于6孔板，将细胞分为6组：空白对照组(mock组)、阴性对照组(Flag-empty组)和CBX8过表达组(Flag-CBX8组)；空白对照组(mock组)、阴性对照组(sh-Luc组)和CBX8沉默组(sh-CBX8组)。次日，按分组转染细胞，Flag-empty和Flag-CBX8每孔3 μg，脂质体6.6 μL；sh-Luc和sh-CBX8的感染复数为200。

2.5 MTT检测细胞活力 分别取转染0 h、48 h、72 h和96 h的细胞，PBS清洗，加入MTT反应液，37 ℃温育4 h，每孔加150 μL 二甲基亚砜液，将培养板置于微孔板振荡器上振荡10 min，使结晶物溶解，酶标仪570 nm测吸光度值。

2.6 BrdU检测细胞增殖 取转染48 h的细胞，将细胞以每孔5×103个接种至96孔板内，24 h后进行BrdU检测。按照BrdU细胞增殖检测试剂盒检测的步骤进行操作。

2.7 流式细胞术检测细胞凋亡 取转染48 h的细胞，PBS清洗，按照 Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒参照说明书操作，在流式细胞仪上检测细胞凋亡。

2.8 Westen blot检测蛋白表达 取适量人脑组织提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜，5%脱脂奶粉封闭，4 ℃下用抗CBX8和β-actin(均为1∶300)I 抗孵育过夜，PBST洗膜3次，II 抗(均为1∶300)室温孵育1 h，PBST洗膜3次，最后用ECL发光液在暗室曝光并压片。

取转染48 h的细胞，BCA法测定蛋白浓度。按照上述方法分析CBX8、caspase-3、p-Rb和E2F1蛋白的表达水平。

取对数期U87MG和T98G细胞以5×105/cm2接种于6孔板，分别将细胞分为5组：空白对照组(mock组)、阴性对照组(Flag-empty组)、CBX8过表达组(Flag-CBX8组)、E2F1沉默组(sh-E2F1组)和CBX8过表达同时沉默E2F1组(Flag-CBX8+sh-E2F1组)。按分组转染细胞，48 h后提取细胞总蛋白，按上述方法分析cyclin D1、Bcl-2和Bax蛋白的表达水平。

2.9 实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测mRNA的表达 Trizol法分别提取人正常脑组织和胶质瘤组织的总RNA，并检测其纯度以及完整性。参照逆转录试剂盒说明书生成cDNA，扩增cDNA，CBX8基因扩增成功后，采用比较Ct值法(2-ΔΔCt)对CBX8含量进行定量分析。RT-qPCR反应条件为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循环40次；72 ℃ 7 min。引物由上海生工生物工程公司合成，序列见表1。

表1 引物序列

F: forward; R: reverse.

分别取转染48 h的细胞，Trizol法提取总RNA，按照上述方法分析E2F1的mRNA表达水平。

取对数期U87MG细胞和T98G细胞以5×105/cm2接种于6孔板，分别将细胞分为5组：空白对照组(mock组)、阴性对照组(Flag-empty组)、CBX8过表达组(Flag-CBX8组)、E2F1沉默组(sh-E2F1组)和CBX8过表达同时沉默E2F1组(Flag-CBX8+sh-E2F1组)。按分组转染细胞，48 h后提取细胞总RNA，按上述方法分析cyclin D1、Bcl-2和Bax mRNA的表达水平。

3 统计学处理

应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，计量资料结果用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较用单因素方差分析，各组均数间两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 人神经胶质细胞瘤中CBX8蛋白与mRNA的表达水平上调

Western blot结果显示，与正常脑组织相比，神经胶质瘤组织(Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ级肿瘤组织)中CBX8蛋白的表达显著上升，各级胶质瘤组织中CBX8的表达并无明显差异；与星形胶质细胞相比，神经胶质瘤细胞系中CBX8蛋白表达水平也明显上升。RT-qPCR结果与Western blot结果一致，神经胶质瘤组织和神经胶质瘤细胞系中的CBX8 mRNA的表达水平明显上调(P<0.05)，见图1。

Figure 1.The expression of CBX8 in the glioma tissue (A) and glioma cell lines (B) validated by Western blot and RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal；#P<0.05vsastrocytes.

图1 胶质瘤组织以及胶质瘤细胞系中CBX8的表达

2CBX8过表达促进人脑胶质瘤细胞的增殖

Western blot结果显示，按实验分组感染T98G细胞与U87MG细胞后，与对照组相比，过表达组细胞CBX8 蛋白表达量增加(图2A)，沉默组细胞CBX8 蛋白表达量下降(图2B)。

MTT结果显示，与对照组相比，CBX8过表达的T98G细胞和U87MG细胞的活力明显上升。而CBX8沉默的T98G和U87MG细胞活力显著下降(P<0.05)。BrdU实验与MTT实验的结果一致，表明CBX8促进人脑胶质瘤细胞的增殖，见图2C、D。

Figure 2.The effects of CBX8 on the proliferation of T98G and U87MG cells. Flag-CBX8 (A) and sh-CBX8 (B) were transfected into T98G cells and U87MG cells, and Western blot was used to determine the CBX8 expression after transfection for 48 h. The proliferation of the T98G cells and U87MG cells was detected by MTT assay and BrdU staining after Flag-CBX8 (C) or sh-CBX8 (D) transfection for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmock.

图2 CBX8对胶质瘤T98G细胞和U87MG细胞增殖的影响

3CBX8过表达抑制人脑胶质瘤细胞的凋亡

流式细胞术分析结果显示，与对照组相比，CBX8过表达的T98G细胞和U87MG细胞早期凋亡以及晚期凋亡百分比都明显下降，而CBX8沉默的T98G细胞和U87MG细胞凋亡率显著上升(P<0.05)，见图3A、B。

另外，Western blot结果显示，与对照组相比，CBX8过表达的T98G细胞和U87MG细胞中凋亡蛋白caspase-3的表达显著降低，而CBX8沉默的T98G和U87MG细胞中caspase-3蛋白的表达则显著升高(P<0.05)，见图3C、D。这些结果表明，CBX8抑制人脑胶质瘤细胞的凋亡。

4CBX8过表达通过上调Rb/E2F1通路促进人脑胶质瘤细胞增殖

Western blot 结果显示，与对照组相比，CBX8过表达使T98G和U87MG细胞内p-Rb和E2F1的蛋白水平都显著上升。而CBX8沉默使细胞内p-Rb和E2F1的蛋白水平都显著下降。另外，CBX8过表达显著提高了cyclin D1和Bcl-2/Bax比值，E2F1 shRNA则使其水平明显降低，而在沉默E2F1的前提下，CBX8过表达对cyclin D1和Bcl-2/Bax的水平并没有影响(P<0.05)。RT-qPCR结果与Western blot结果一致，可见，CBX8过表达可能通过上调E2F1通路促进细胞增殖并抑制细胞凋亡，见图4。

Figure 3.The effects of CBX8 on the apoptosis of T98G cells and U87MG cells. Flag-CBX8 and sh-CBX8 were transfected into the T98G cells and U87MG cells. The apoptosis of T98G cells and U87MG cells was detected by flow cytometry after Flag-CBX8 (A) or sh-CBX8 (B) transfection for 48 h. The expression of cleaved caspase-3 protein was detected by Western blot after Flag-CBX8 (C) or sh-CBX8 (D) transfection for 48 h. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmock.

图3 CBX8对胶质瘤T98G细胞和U87MG细胞凋亡的影响

讨 论

神经胶质瘤是常见的颅内肿瘤，由于无法控制的细胞增殖、肿瘤细胞的侵袭性以及新生血管生长等生物学行为，而面临严峻的治疗难题[10]。PcG蛋白是在果蝇体内发现的第一个通过染色质修饰调控靶基因的转录抑制子的蛋白，分为PRC1和PRC2两种蛋白复合物。PcG蛋白的异常状态能够导致癌症的发生[11-12]。CBX8又叫多梳蛋白3(polycomb protein，HPC3)，在PRC1中作为转录抑制因子，可与BMI1相互结合[6, 13]。近年来，CBX8对细胞功能的调节作用逐渐被发现，有研究表明，CBX8沉默通过促进INK4A-ARF通路调节纤维细胞增殖[14]。在结肠癌中，CBX8沉默明显抑制细胞的增殖[6]。然而CBX8在神经胶质瘤细胞中的作用目前尚不清楚，本文旨在研究CBX8对神经胶质瘤细胞增殖凋亡的影响及其相关机制。

Figure 4.The effects of CBX8 on the expression of Rb/E2F1 in T98G and U87MG cells. Flag-CBX8, sh-CBX8 and sh-E2F1 were transfected into the T98G cells and U87MG cells. The effects of Flag-CBX8 (A) and sh-CBX8 (B) on the expression of Rb/E2F1 in the T98G cells and U87MG cells were determined by Western blot and RT-qPCR after transfection for 48 h. The effects of sh-E2F1 and Flag-CBX8 on cyclin D1, Bcl-2 and Bax levels in the T98G cells (C) and U87MG cells (D) were detected by Western blot and RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmock.

图4 CBX8对胶质瘤T98G细胞和U87MG细胞中Rb/E2F1表达的影响

有研究发现，PcG蛋白在神经胶质瘤中异常表达，其中CBX7、CBX6等表达显著降低，而CBX8表达显著升高，并且CBX6过表达显著抑制胶质瘤细胞的增殖[7]。本实验结果表明，与正常脑组织及人胚脑星形胶质细胞相比，神经胶质瘤组织及细胞中的CBX8蛋白和mRNA水平明显上升，这可能与神经胶质瘤的发展有着密切的关系。因此，本实验将CBX8过表达和沉默载体转染入神经胶质瘤T98G细胞和U87MG细胞，检测细胞增殖凋亡情况，结果显示，过表达CBX8促进胶质瘤细胞增殖并抑制细胞凋亡，而沉默CBX8抑制胶质瘤细胞增殖并促进细胞凋亡。

Rb基因家族处于细胞周期调控的中心环节，在细胞生长和分化的调控中发挥重要作用。E2F1作为重要的细胞周期调控因子，与Rb共同参与调控细胞由G0/G1期向S期的过渡[15]。研究表明，E2F1通过调节细胞周期促进胶质瘤细胞的增殖[16]，而CBX8能够通过Rb-E2F1通路调节白血病细胞衰老[5]。作为周期蛋白，cyclin D1的过度表达会使细胞周期失控，从而导致恶性转化[17]。因此，cyclin D1已经作为抑制肿瘤细胞增殖的靶分子被广泛研究[18-19]。过表达CBX8提高cyclin D1的表达，使细胞G1期缩短，持续增殖。细胞程序性死亡的调节因子Bcl-2与Bax的比值反映了胶质瘤细胞增殖或凋亡的过程，当Bcl-2/Bax比值增大，细胞趋向增殖[20]。本实验结果表明，CBX8过表达促进胶质瘤细胞系Rb/E2F1通路的激活;反之，CBX8沉默显著降低细胞中Rb/E2F1的激活。另外，CBX8过表达显著提高了cyclin D1和Bcl-2/Bax的水平，E2F1 shRNA则使其水平明显降低，而在沉默E2F1的前提下，CBX8过表达对cyclin D1和Bcl-2/Bax的水平并没有影响。因此，结合参考文献我们推测，CBX8可能通过Rb/E2F1通路，调节相关蛋白cyclin D1、Bcl-2和Bax的表达，从而调控神经胶质瘤细胞的增殖和凋亡。

综上所述，本研究通过构建过表达和沉默CBX8载体并转染神经胶质瘤细胞T98G和U87MG，发现CBX8可通过激活Rb/E2F1通路促进T98G和U87MG细胞增殖并抑制细胞凋亡。这一结果初步阐明了CBX8诱导神经胶质瘤发生的相关机制，为神经胶质瘤的治疗提供了新思路。

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(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

Effects of silencing and overexpression of CBX8 on proliferation and apoptosis of human glioma cells

ZHANG Bai-ping, SUN Shu-kai, JIA Dong

(DepartmentofNeurosurgery,TangduHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710038,China.E-mail:shidasda@163.com)

AIM: To explore the effects of chromodomain protein 8 (CBX8) on the proliferation and apoptosis of human glioma cells. METHODS: The expression of CBX8 in the tissues and cells was detected by Western blot and RT-qPCR. The overexpression (Flag-CBX8) and silencing (sh-CBX8) vectors ofCBX8 were constructed and transfected into glioma T98G cells and U87MG cells. The cell proliferation was detected by MTT assay and BrdU staining. The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry. The protein expression of Rb/E2F1 was detected by Western blot. RESULTS: Compared with normal brain tissues and astrocytes, the expression of CBX8 was increased in the glioma tissues and glioma cells. Overexpression ofCBX8 promoted the cell proliferation, inhibited the cell apoptosis, and upregulated the protein levels of Rb/E2F1. On the contrary, silencing ofCBX8 inhibited the cell proliferation, promoted the cell apoptosis, and decreased the protein levels of Rb/E2F1 in the T98G cells and U87MG cells. Moreover, the expression of cyclin D1 and Bcl-2/Bax ratio were reduced after transfection with sh-E2F1 in the T98G cells and U87MG cells.CONCLUSION: CBX8 may regulate the proliferation and apoptosis of glioma cells through Rb/E2F1 pathway.

Glioma; Chromodomain protein 8; T98G cells; U87MG cells

1000- 4718(2017)04- 0723- 07

2016- 11- 23

2016- 12- 29

R730.23; R739.4

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.024

△通讯作者 Tel: 13519182336； E-mail： shidasda@163.com