侧流暗场成像技术观察内毒素休克兔小肠绒毛与舌下微循环改变*

高 飞， 傅小云， 钱明江， 张 宇， 李光素， 胡 杰

(遵义医学院附属医院重症医学科， 贵州 遵义 563003)

·实验技术·

侧流暗场成像技术观察内毒素休克兔小肠绒毛与舌下微循环改变*

高 飞， 傅小云△， 钱明江， 张 宇， 李光素， 胡 杰

(遵义医学院附属医院重症医学科， 贵州 遵义 563003)

目的： 利用侧流暗场(sidestream dark-field，SDF)成像技术观察比较内毒素休克兔经液体复苏至同一目标血压水平下小肠绒毛微循环及舌下微循环变化的异同。方法: 新西兰大白兔60只，随机分为绒毛组及舌下组，每组30只。2组均行体外回肠造口术，用细菌脂多糖注射建立内毒素休克模型。建模成功后用乳酸林格氏液以复苏剂量30 mL·kg-1·h-1进行液体复苏使平均动脉压(MAP)达到80 mmHg为目标血压。若经单纯液体复苏，血压仍不能达标者，则予以去甲肾上腺素0.5～1 μg·kg-1·min-1维持至目标血压。通过SDF成像技术持续观察2组动物休克前后以及液体复苏后的小肠绒毛及舌下微循环灌注指标：绒毛血管数量(vessels per villus，VV)、微血管血流指数(microvascular flow index，MFI)、灌注绒毛比例(proportion of perfused villi，PPVi)、绒毛边界量化评分、绒毛血管评分、总的血管密度(total vessel density，TVD)、灌注血管密度(perfused vessel density，PVD)、灌注血管比例(proportion of perfused vessels，PPVe)等的变化并比较两者灌注特点的异同。结果: 休克后，小肠绒毛MFI、PPVi以及舌下微循环MFI、PPVe、TVD、PVD较休克前均显著下降(P<0.01)，其中小肠绒毛微循环MFI显著低于舌下微循环(P<0.01)；经液体复苏至MAP达到目标血压后，小肠绒毛MFI、PPVi以及舌下微循环MFI、PPVe、TVD、PVD较休克后均有明显上升(P<0.05)，但复苏后的小肠绒毛微循环MFI仍明显低于舌下微循环(P<0.01)。结论: 内毒素休克兔小肠绒毛与舌下微循环灌注变化有差异，休克后小肠绒毛微循环灌注下降程度较舌下微循环更显著，而液体复苏后小肠绒毛微循环灌注恢复程度亦低于舌下微循环。

侧流暗场成像； 微循环； 内毒素休克； 液体复苏

脓毒症休克早期液体复苏治疗达标后，宏观的血流动力学恢复，但微循环功能障碍仍然可能存在[1]。脓毒症休克期间，不同部位不同脏器的微循环功能障碍的发生时间和下降程度并非完全一致[2]，胃肠道是休克发生后最早受累的器官之一[3-4]。侧流暗场(sidestream dark-field，SDF)成像技术是手持式正交极化频谱(orthogonal polarization spectral，OPS)成像技术的衍生技术，由排列在探测器末端的二极管频闪光源发出与血红蛋白吸收波长(550 nm)相近的独立极化绿色光源[(540±50) nm]，可以监测到组织内部的微循环血流变化。SDF技术上较OPS更成熟，形成图像更清晰[5]，且更轻便、廉价。至1999年被用于临床以后，其对器官微循环的监测作用才逐渐被证实认同[6]。目前主要应用于舌下、骨骼肌、肝脏、膈肌以及小肠绒毛等组织的微循环监测中[6]。因观察部位的限制，既往的研究主要集中在舌下微循环，但据证实舌下微循环和肠道微循环结构上及数据分析间均存在实质性差异，故而舌下微循环的改变并不一定能完全反映肠道微循环的改变[7-8]。本实验试图获得实时内毒素休克下肠绒毛与舌下微循环变化的图像及参数，为SDF成像技术用于脓毒症休克时床旁器官微循环功能监测、疗效评估奠定前期研究基础。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 实验动物 新西兰大白兔60只，体重2～2.5 kg，雌雄不拘，母兔未孕，产地重庆，许可证号为SCXK-(军)2012-0003。

1.2 主要试剂及仪器 细菌脂多糖(lipopolysaccha-ride，LPS)购于Sigma。LH-SDF-1型侧流暗场成像观测仪、支架、X-Y工作台、独立极化光源及外置光源、微循环分析工作站中文版(徐州利华电子科技发展有限公司)；PM-9000监护仪(上海杰韦弗医疗器械有限公司)；BL-420F生物机能实验系统(成都泰盟软件有限公司)。

2 方法

2.1 麻醉与术前准备 手术前均被饲养在环境温度为21 ℃的饲养笼内，自由饮水进食。术前禁食、不禁水过夜。腹腔内注入戊巴比妥30 mg/kg诱导麻醉。剔除标准：不适应饲养条件，术前、术中产生强烈应激反应;建模时血压下降超出标准或因休克死亡;复苏后血压不达标。

2.2 实验分组 实验开始前将60只兔随机分为绒毛组及舌下组，每组30只。

2.3 手术步骤 于股动脉内置入24 G聚乙烯导管用于连续性有创动脉监测。股静脉内置入24 G聚乙烯导管用于复苏治疗通道。为排除呼吸道风险，行气管切开，并置入14 G气切导管开放气道。经腹正中线剖腹，根据大白兔回肠末端特有的“圆小囊”结构确定回肠后，暴露回肠近端5 cm至远端4 cm段至体外，小心处理肠系膜，充分游离外置回肠段，并小心放置在可调节的小塑料板上以避免呼吸运动所产生的伪影。实验中除在SDF成像取图时，均间断给予以37 ℃温盐水饱和药棉拭子轻蘸肠管表面润湿以减少脱水。术中维持肛温及有创动脉血压稳定。

2.4 建立内毒素休克模型 2组均行体外回肠造口成功后经股静脉注射LPS 2 mg/kg，建立内毒素休克模型，在注入LPS后15 min内，以较注药前平均动脉压(mean arterial pressure, MAP)下降30%～45%为建模成功的标准。

2.5 液体复苏 建模成功后以乳酸林格氏液按复苏剂量及目标血压进行液体复苏，最终维持MAP在目标水平(80 mmHg)。若给予规定剂量乳酸林格氏液液复苏后血压仍不能达标者，则予以适量去甲肾上腺素(0.5～1 μg·kg-1·min-1)维持至目标血压。实验过程绒毛组7只，舌下组8只实验兔，共计15只动物需要持续静脉泵入去甲肾上腺素协助维持血压至目标血压水平。

2.6 SDF成像技术观察微循环 回肠造口术成功后连同专门制作的兔台可靠放置在X-Y工作台上，保证SDF设备放置合理、稳定，连接光源，电脑，启动微循环工作站。分别采集2组动物休克前、休克时以及复苏过程中的SDF图像及视频片段、收集数据并记录时间。术前、术中尽量减少和/或排除可能影响肠道微循环的因素。

2.7 各定量及半定量参数的记录与测定 参照2014年荷兰圆桌会议推荐的小肠绒毛微循环参数评价系统[9]与2007年荷兰圆桌会议推荐的舌下微循环参数系统[10]分别记录小肠绒毛与舌下微循环变化，利用中国徐州利华电子科技发展有限公司研发的微循环分析工作站(中文版)联合进行同步图像及视频帧分析，整理小肠绒毛及舌下微循环定量参数。

3 统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，正态分布资料用均数±标准差(mean±SD)表示，重复测量资料采用重复测量方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 小肠灌注绒毛比例(proportion of perfused villi，PPVi)与绒毛微血管血流指数(microvascular flow index，MFI)的变化

休克后小肠绒毛的PPVi和MFI分别较休克前显著降低(P<0.01)；液体复苏后的PPVi和MFI则较休克后增加(P<0.01)，但均未恢复至休克前水平,见表1。

表1 小肠灌注绒毛比例及绒毛微血管血流指数的变化

Table 1.The changes of proportion of perfused villi (PPVi) and microvascular flow index (MFI) of villi in the small intestine villus (Mean±SD.n=30)

GroupPPViMFIBeforeshock0.43±0.052.92±0.12Aftershock0.13±0.03**1.05±0.03**Afterfluidresuscitation0.38±0.05**#1.97±0.11**#

**P<0.01vsbefore shock;#P<0.05vsafter shock.

2 舌下微循环总的血管密度(total vessel density，TVD)、灌注血管密度(perfused vessel density，PVD)及灌注血管比例(proportion of perfused vessels，PPVe)的变化

休克后舌下微循环的TVD、PVD及PPVe较休克前均明显下降，差异具有统计学意义(P<0.01)；液体复苏后的TVD、PVD及PPVe则均较休克后增加(P<0.01)，但与休克前比较差异仍有统计学显著性(P<0.05)，见表2。

表2 舌下微循环TVD、PVD和PPVe的变化

Table 2.The changes of TVD, PVD and PPVe in the sublingual microcirculation (Mean±SD.n=30)

GroupTVD(vessels/mm2)PVD(vessels/mm2)PPVe(%)Beforeshock17.76±3.3412.78±3.0576.67±3.65Aftershock11.12±1.02*6.34±1.55*43.24±1.86*Afterfluidresuscitation16.74±2.09*#12.04±2.75*#68.13±3.13*#

*P<0.05vsbefore shock;#P<0.05vsafter shock.

3 小肠绒毛MFI与舌下微循环MFI变化程度的比较

休克后小肠绒毛MFI和舌下MFI较休克前均有显著下降(P<0.01)。经液体复苏至目标血压后，小肠绒毛MFI与舌下微循环MFI较休克后增加(P<0.05)，但均未恢复至休克前水平。休克后绒毛微循环MFI的变化程度较舌下微循环MFI的变化程度大，但液体复苏后，绒毛微循环MFI的变化程度较舌下微循环MFI的变化程度小，见表3。

表3 小肠绒毛MFI及舌下MFI的比较

Table 3.Comparison of MFI between small intestine villus and sublingual microcirculation (Mean±SD.n=30)

GroupMFIofsmallintestinevilliMFIofsublingualmicrocirculationBeforetheshock2.92±0.142.99±0.12Aftertheshock1.05±0.08*2.16±0.14*Afterfluidresuscitation1.97±0.11*#2.76±0.22*#

*P<0.05vsbefore shock;#P<0.05vsafter shock.

4 小肠绒毛和舌下微循环随休克进展及液体复苏过程的变化

休克尚未发生前，小肠绒毛微循环灌注血管充盈良好，小肠绒毛及舌下微循环内的微血管网内红细胞流动状态清晰可见，小肠绒毛结构完整无碎裂。休克发生后，随MAP下降，小肠绒毛与舌下微循环灌注血管管径变细，血流速度逐渐减慢、间歇停止甚至出现血液完全停止流动，灌注微血管数逐渐减少甚至消失。小肠绒毛肿胀程度迅速进展并继之出现绒毛顶端碎裂且碎裂程度逐渐加重，最终绒毛结构完整性遭到完全破坏。经液体复苏后，小肠绒毛及舌下微循环灌注较休克后改善，但舌下微循环灌注恢复优于同期小肠绒毛，但部分区域微血管灌注仍不均衡,小肠绒毛结构无恢复，见图1。

讨 论

微循环是指微动脉和微静脉之间的血液循环，基本功能是进行新陈代谢及物质的交换[7]。它是直径(diameter,D)小于100 μm脉管的总和，根据直径不同分成小微血管(D<20 μm)、中微血管(20 μm≤D<50 μm)和大微血管(50 μm≤D<100 μm)。一个完善的微循环系统保障了全身器官的灌注。脓毒症时的病理生理改变是以微循环障碍为主的全身炎症反应。休克发生时，重要器官微循环血流灌注减少，引起缺血、缺氧，使微循环内皮细胞肿胀，微血管管壁通透性升高，组织水肿，氧摄取障碍逐渐加重，严重影响细胞的能量代谢，导致细胞功能障碍。因此，脓毒症本质上也是一种微循环疾病[11]。

Figure 1.The changes of small intestine villus and sublingual microcirculation perfusion in the rabbits during endotoxic shock observed by SDF.

图1 小肠绒毛微循环及舌下微循环在休克不同时期的变化

SDF成像数据分析为定量、半定量分析，图像处理软件进行半自主化血管识别以形成在活体组织拍摄基础上更为清晰的血管图像。参照2014年荷兰圆桌会议推荐的小肠绒毛微循环参数评价系统[9]与2007年荷兰圆桌会议推荐的舌下微循环参数系统[10]，要求每个观测视野内必须包括3～10个绒毛便于分析，每个单个的、独立的绒毛微循环为一个分析单元，分析时尽量计数每个单元内的微血管数、每个视野中绒毛微血管平均数，其中重点关注视野内每条微血管内的血流状态即绒毛微血管血流指数：正常为连续流动状态，计3分；低灌注为缓慢或间歇流动状态，计2分；无流动状态，计1分，据此量化视野内所有绒毛的平均MFI。灌注绒毛比例也可根据视野内正常流量(MFI=3)的绒毛数量与视野内可供分析的总的绒毛数量的比值×100%而获得；绒毛边界量化评分：边界完整者计2分；边界破坏<50%者计1分；边界破坏>50%者计0分。舌下MFI与绒毛血流状态量化方法相同。但因舌下微循环的图像呈现的是一个平面，而反映绒毛微循环的图像却是一个三维立体呈现，基于这样的差异，所以用于舌下微循环测量中的总的血管密度、灌注血管密度等指标则不推荐应用于肠道绒毛微循环的监测中。

本实验通过建立内毒素休克模型，获得了活体微循环观测窗并利用SDF成像技术成功采集到高质量小肠绒毛及舌下微循环灌注图像及视频片段，观察记录到休克前、休克达标时及液体复苏至目标血压后的小肠绒毛及舌下微循环灌注情况，应用特定的定量、半定量及定性参数评价系统[9-10]，比较了液体复苏前后对肠道微循环与舌下微循环灌注变化的异同。结果表明：休克尚未发生前，观测到小肠绒毛的微循环灌注血管充盈良好，血流速度快，小肠绒毛及舌下微循环内的微血管网内红细胞流动状况清晰可见。注入内毒素后，随着MAP下降，休克进展，小肠绒毛灌注血管管径变细，血流速度逐渐减慢、间歇停止甚至出现血液停止流动，灌注微血管数逐渐减少甚至消失殆尽，PPVi迅速下降，小肠绒毛微循环灌注锐减。同样的变化在舌下微循环中亦能观察到。这与之前的一些研究脓毒症及脓毒症休克状态下微循环改变的动物实验或临床研究的相关发现一致，例如：灌注血管密度的减少，血液流动状态的改变(缓慢、间歇甚至停止流动)等[12-21]。另一方面从形态上观察，休克未发生前，小肠绒毛结构完整无碎裂。随休克进展，绒毛灌注微血管数明显减少，小肠绒毛肿胀程度迅速进展并继之出现绒毛顶端碎裂且碎裂程度逐渐加重，最终绒毛结构完整性遭到完全破坏。绒毛碎裂严重程度与MAP降低程度相关。

休克发生后，上述由灌注下降导致绒毛及舌下微循环内各种变化的原因可能与小肠与口腔颌面颈部的血液供应的解剖学构筑特点的不同、休克发生后对重要器官血流的2次分配以及肠绒毛与舌下微血管本身的异质性3种因素有关。口腔颌面颈部拥有充足的血液供应，而回肠的血液供应则主要来源为肠系膜上动脉，吻合血管网相对较少且需供应的器官组织较多。因此，舌及舌下与小肠血液供应的解剖学构筑特点的不同可能是造成两者微循环灌注变化不同的一个重要因素。其次，休克早期，由于有效循环血量的减少，动脉血压的降低，导致一系列压力、体液调节机制发生，选择性地收缩外周和内脏血管使循环血量重新分配，以达到保证心、脑等重要器官的有效灌注的目的。休克发生时，胃肠道、皮肤及骨骼肌等部位的血管首先收缩，尤以肠系膜上动脉阻力明显增高[22]，血供显著减少，因此成为休克后两者微循环灌注变化不同的另一个重要因素。再次，肠绒毛微血管呈弯曲的线圈状，其直径在10 μm以下，尤其在血管弯曲的襻顶部分，血流速度较襻直部分更慢，而舌下微血管直而长且血管直径普遍较绒毛微血管更大，当相同的病理状态发生后，肠绒毛微血管的自身调节能力较舌下微血管更弱，更易受灌注血流减少的影响。这也可能是说明在休克早期，肠道功能会因灌注的改变而较早发生功能损伤的原因。

实验中亦观察到液体复苏后绒毛微循环内灌注上升的变化低于舌下微循环。目前已证实脓毒症性休克时，因血管内皮细胞损伤，多糖包被暴露，微血栓形成、毛细血管渗漏、白细胞滚动和红细胞叠连，引起微循环血流异常，而内皮细胞的调节能力在此过程中起着核心作用。液体复苏后肠绒毛及舌下微循环灌注恢复程度不同可能与休克时对肠绒毛微循环功能的影响及打击更大以及绒毛微血管的自身调节能力较舌下微血管更弱等原因有关。

本实验着眼于观察分析活体动物内毒素休克时及液体复苏至不同目标血压后肠道绒毛及舌下微血管灌注的实时变化。研究表明，即使在相同的病理生理状态下，不同器官组织之间微循环功能状态可能存在差异，其变化特点仍需大量实验研究揭示。

[1] Donati A, Domizi R, Damiani E. From macrohemodyna-mic to the microcirculation[J]. Crit Care Res Pract, 2013, 2013：892710.

[2] Trzeciak S, Rivers EP. Clinical manifestations of disor-dered microcirculatory perfusion in severe sepsis[J]. Crit Care, 2005, 9(Suppl 4):S20-S26.

[3] 张淑文. 脓毒症与急性肠衰竭[J]. 继续医学教育, 2008, 22(1):37-42.

[4] Cullen JJ, Caropreso DK, Ephgrave KS. Effect of endotoxin on canine gastrointestinal motility and transit[J]. J Surg Res, 1995, 58(1):90-95.

[5] Ince C. Sidestream dark field imaging: an improved technique to observe sublingual microcirculation[J]. Crit Care, 2005, 9(Suppl 1):P72.

[6] Groner W, Winkelman JW, Harris AG, et al. Orthogonal polarization spectral imaging: a new method for study of the microcirculation[J]. Nat Med, 1999, 5(10):1209-1212.

[7] Verdant CL, De Backer D, Bruhn A, et al. Evaluation of sublingual and gut mucosal microcirculation in sepsis: a quantitative analysis[J]. Crit Care Med, 2009, 37(11):2875-2881.

[8] Boerma EC, van der Voort PHJ, Spronk PE, et al. Relationship between sublingual and intestinal microcirculatory perfusion in patients with abdominal sepsis[J]. Crit Care Med, 2007, 35(4):1055-1060.

[9] Lehmann Ch, Abdo I, Kern H, et al. Clinical evaluation of the intestinal microcirculation using sidestream dark field imaging: recommendations of a round table meeting[J]. Clin Hemorheol Microcir, 2014, 57(2):137-146.

[10]De Backer D, Hollenberg S, Boerma C, et al. How to evaluate the microcirculation: report of a round table conference[J]. Crit Care, 2007, 11(5):R101.

[11]Vincent JL, De Backer D. Microvascular dysfunction as a cause of organ dysfunction in severe sepsis[J]. Crit Care, 2005, 9(Suppl 4):S9-S12.

[12]Legrand M, Klijin E, Payen D, et al. The response of the host microcirculation to bacterial sepsis: does the pathogen matter?[J]. J Mol Med (Berl), 2010, 88(2):127-133.

[13]Piagnerelli M, Boudjeltia KZ, Vanhaeverbeek M, et al. Red blood cell rheology in sepsis[J]. Intensive Care Med, 2003, 29(7):1052-1061.

[14]Lush CW, Kvietys PR. Microvascular dysfunction in sepsis[J]. Microcirculation, 2000, 7(2):83-101.

[15]Boerma EC. Distributive failure in the microcirculation of septic patients[D]. Amsterdam: University of Amsterdam, 2009.

[16]Eerbeek O, Milstein DM, Ince C. Microcirculatory dysfunction in Langendorff endotoxemic rat hearts[J]. Shock, 2004, 21:81.

[17]Spronk PE, Zandstra DF, Ince C. Bench-to-bedside review: sepsis is a disease of the microcirculation[J]. Crit Care, 2004, 8(6):462-468.

[18]符庆瑛， 李著华， 张艳青， 等. PGI2对肾缺血再灌损伤兔肠系膜微循环和血液流变性的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2005, 21(2):361-366.

[19]De Backer D, Creteur J, Preiser JC, et al. Microvascular blood flow is altered in patients with sepsis[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2002, 166(1):98-104.

[20]Klijin E, Den Uil CA, Bakker J, et al. The heterogeneity of the microcirculation in critical illness[J]. Clin Chest Med, 2008, 29(4):643-654.

[21]Vallet B. Endothelial cell dysfunction and abnormal tissue perfusion[J]. Crit Care Med, 2002, 30(5 Suppl):S229-S234.

[22]Hotchkiss RS, Karl IE. The pathophysiology and treatment of sepsis[J]. N Engl J Med, 2003, 348(2):138-150．

(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Changes of small intestine villus and sublingual microcirculation in rabbits during endotoxic shock observed by sidestream dark-field imaging

GAO Fei, FU Xiao-yun, QIAN Ming-jiang, ZHANG Yu, LI Guang-su, HU Jie

(DepartmentofCriticalCareMedicine,TheFirstAfiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China.E-mail: 422318085@qq.com)

AIM: To investigate the changes of small intestine villus and sublingual microcirculation perfusion in the rabbits during endotoxic shock by sidestream dark-field imaging (SDF) after resuscitation to a mean arterial pressure (MAP) level.METHODS: New Zealand white rabbits (n=60) were randomly divided into 2 groups (group of villus and group of sublingua). The fistula operation of ileum was performed. Lipopolysaccharide was injected to establish endotoxic shock model, and fluid resuscitation (lactated Ringer’s solution, 30 mL·kg-1·h-1) was given to maitain the MAP of the animals to 80 mmHg. Continuous norepinephrine was intravenously injected at 0.5～1 μg·kg-1·min-1only if fluid therapy did not maintain the MAP level. The changes of microcirculatory perfusion indexes in small intestine villus and sublingual tissues such as vessels per villus (VV), microvascular flow index (MFI), proportion of perfused villi (PPVi), villus border score, villus vessel score, total vessel density (TVD), perfused vessel density (PVD) and proportion of perfused vessels (PPVe) were continuously observed and recorded by SDF before shock, during shock and after fluid resuscitation. RESULTS: MFI and PPVi in small intestine villus, and MFI, PPVe, TVD and PVD in sublingual tissues were significantly decreased after shock (P<0.01). Compared with MFI in sublingual microcirculation, MFI in villus was significantly decreased (P<0.01). MFI and PPVi in small intestine villus, and MFI, PPVe, TVD and PVD in sublingual tissues were improved after recovered to the target MAP by fluid resuscitation (P<0.05). However, MFI in small intestine villus was significantly lower than that in sublingual tissues after fluid resuscitation (P<0.01).CONCLUSION: The difference between small intestine villus and sublingual microcirculation perfusion during endotoxic shock is observed. The descent degree of microcirculation perfusion in small intestine villus is larger than that in sublingual tissues after shock, and the recovery degree of small intestine villus microcirculation is lower than that of sublingual microcirculation afer fluid resuscitation.

Sidestream dark-field imaging; Microcirculation; Endotoxic shock; Fluid resuscitation

1000- 4718(2017)04- 0764- 05

2016- 10- 14

2016- 12- 29

国家自然科学基金资助项目(No. 81560308)；贵州省科学技术基金资助项目(黔科合J字[2010]2180号)

R363; R515.3

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.032

△通讯作者 Tel: 0851-28608514; E-mail: 422318085@qq.com