自噬参与香烟烟雾提取物诱导的肺动脉内皮细胞凋亡*

薛 鸿， 王 虹， 许能銮， 陈愉生， 苏 建， 解卫平

(1福建医科大学省立临床医学院福建省立医院呼吸内科,福建省呼吸四病研究室， 福建 福州 350001； 2南京医科大学附属第一医院呼吸内科，江苏 南京 210029； 3江苏省疾病预防控制中心慢性非传染病防制所，江苏 南京 210009)

自噬参与香烟烟雾提取物诱导的肺动脉内皮细胞凋亡*

薛 鸿1△， 王 虹2， 许能銮1， 陈愉生1， 苏 建3， 解卫平2

(1福建医科大学省立临床医学院福建省立医院呼吸内科,福建省呼吸四病研究室， 福建 福州 350001；2南京医科大学附属第一医院呼吸内科，江苏 南京 210029；3江苏省疾病预防控制中心慢性非传染病防制所，江苏 南京 210009)

目的： 探讨自噬在香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract, CSE)诱导人肺动脉内皮细胞(human pulmonary artery endothelial cells，HPAECs)凋亡中的作用。方法: 常规培养HPAECs，分为对照组、CSE组、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)组和3-MA+CSE组，应用Hoechst 33342 染色和 Annexin V/PI 流式细胞术检测细胞凋亡，单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC)染色观察细胞自噬泡形成，Western bolt 测定自噬相关蛋白 beclin-1、LC3 与cleaved caspase-3的水平。结果: MDC染色示CSE处理可以诱导细胞产生自噬泡，Western blot结果示自噬相关蛋白LC3及beclin-1表达升高，3-MA 预处理后抑制上述蛋白的表达。Hoechst 33342 染色和 Annexin V/PI 流式结果显示CSE组细胞凋亡率较对照组明显增加，在3-MA+CSE组，细胞凋亡率较CSE组进一步升高；同时，CSE组细胞cleaved caspase-3蛋白水平较对照组明显升高(P<0.05)，3-MA+CSE组的caspase-3表达较CSE组进一步升高。结论: CSE能诱导HPAECs发生自噬和凋亡，抑制自噬能够进一步促进CSE对HPAECs的凋亡作用，这种作用可通过激活caspase-3实现。

自噬； 人肺动脉内皮细胞； 香烟烟雾提取物； 细胞凋亡

吸烟可导致慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)，进而诱发肺动脉高压和肺源性心脏病[1-2]。肺血管重构是导致肺动脉高压形成并诱发肺源性心脏病的病理基础。近年来研究发现吸烟可导致肺血管重构。目前认为香烟烟雾诱发人肺动脉内皮细胞(human pulmonary artery endothelial cells，HPAECs)的凋亡是肺动脉高压和肺源性心脏病的促发因素和起始环节。内皮细胞的凋亡可诱发血管平滑肌细胞的异常增生和凋亡抵抗型内皮细胞的出现及广泛增殖，从而引起肺小血管的狭窄和丛状样变，导致肺动脉高压的形成[2-3]。

自噬作为真核细胞的一种基本生物学过程，是一种溶酶体依赖的细胞器和蛋白质周转再利用的过程，近年来在生物学和临床领域引起了广泛重视。越来越多的研究表明，自噬与疾病密切相关。自噬在肺部疾病中具有双重作用，既可做为一种保护作用，又可成为一种损伤机制[4-5]。目前的研究认为细胞自噬和凋亡之间存在自噬协同凋亡促进细胞死亡、自噬抑制凋亡保护细胞和自噬增强凋亡水平促进细胞死亡3种关系，但自噬本身不能导致细胞死亡[6]。自噬是否在香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract，CSE)促进肺动脉内皮细胞凋亡中发挥重要作用，目前尚未见报道。本研究通过建立体外烟雾暴露环境模型刺激肺动脉内皮细胞，观察HPAECs自噬及凋亡的发生，并应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)改变自噬活性观察其对细胞凋亡的影响，探讨香烟烟雾暴露对肺血管损伤的机制。

材 料 和 方 法

1 主要试剂及药物

3-MA、碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液和MTT均购自Sigma；抗beclin-1、cleaved caspase-3抗体购自 Cell Signaling Technology；抗LC-3抗体购自Novus Biologicals；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 II 抗 IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

2 方法

2.1 细胞培养及处理 原代人肺动脉内皮细胞购自 ScienCell 研究实验室。HPAECs用含1%抗生素、1%内皮生长因子和10%胎牛血清的ECM内皮细胞培养液(HyClone)，置于5% CO2、37 ℃、饱和湿度的培养箱中培养。实验取对数生长期的第3～5代HPAECs进行，以约1×108/L 的密度接种于细胞培养板中，待细胞铺板面积达 80%～90%后进行处理。

2.2 CSE的制备，以及CSE时间和浓度梯度实验 按参考文献[7]报道的方法并加以改良。1支香烟(Marlboro)燃烧5 min的烟雾在注射器驱动吸引下溶于10 mL 37 ℃预热的PBS 溶液中，调节 pH至7.4 左右。经 0.22 μm滤膜过滤除菌后作为100% CSE 原液，配置好的原液于1 h内用于实验, 用无血清培养液稀释成不同浓度，CSE浓度(%)= CSE原液体积/总体积×100%。分别配制成 1%、2.5%、5%、10%和20%的CSE用于实验。

HPAECs接种于96 孔细胞培养板中，分别给予无血清培养基和1%、2.5%、5%、10%、20%的 CSE 处理24 h，或 10% CSE 处理 0 h、1 h、2 h、6 h、12 h和24 h后，每孔加20 μL MTT(5 g/L)，置5% CO2、37 °C、饱和湿度的培养箱中孵育4 h，弃去培养液，每孔加入DMSO 100 μL，室温孵育10 min，用酶标仪在 570 nm处测定吸光度。

2.3 药物处理 将HPAECs分为4组：对照组(control组)：细胞在正常条件下培养12 h； CSE组：使用10% CSE处理细胞12 h； 3-MA组：细胞预先用3-MA(10 mmol/L)孵育0.5 h后在正常条件下培养； 3-MA+ CSE组：细胞预先0.5 h用3-MA(10 mmol/L)孵育后使用10% CSE处理细胞12 h。

2.4 Annexin V/PI 双染流式细胞术检测 6 孔细胞培养板中的细胞经相应处理后，用胰酶消化，1 000×g离心5 min (4 ℃)，弃上清，收集细胞，PBS重悬，细胞密度取 1×109/L，1 000×g离心5 min (4 ℃)，弃上清，加入 195 μL Annexin V-FITC 结合液重悬细胞，再加入5 μL Annexin V-FITC，轻微摇匀后，室温避光孵育 15 min，然后再 1 000 r/min 离心 5 min (4 ℃)，弃上清，加入 190 μL Annexin V-FITC 结合液重悬细胞及加入 10 μL PI，立即摇匀，随即进行流式细胞术检测。

2.5 活细胞单丹磺酰尸胺(monodansylcadaverine，MDC)染色荧光显微镜定性观察 6孔细胞培养板中的细胞经相应处理后，用 PBS洗涤 2次后加入终浓度为 0.05 mol/L的MDC溶液。37 ℃避光作用 60 min后弃去染液，PBS洗 3次。于 倒置荧光显微镜(Olympus)350 nm发射滤片下观察和摄片。

2.6 Western bolt检测蛋白水平 细胞经相应处理后，用PBS洗涤3次，用含97.9% RIPA、1% PMSF、1%磷酸酶抑制剂和0.1%蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取总蛋白，制备SDS-PAGE，进行50/100 V 恒压电泳，经 300 mA 恒流转移到 PVDF 膜上，TBST 洗涤后加 5%脱脂牛奶-TBST 37 ℃封闭 1 h，然后加入 抗体 [beclin-1(1∶1 000)、LC3(1∶3 000)、caspase-3(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)]，4 ℃孵育过夜，TBST 洗涤后，加入兔 II抗(1∶8 000)37 ℃孵育 1 h，TBST洗涤后，ECL化学发光试剂显影，Western bolt 的条带用 Quality One 软件分析，所有的结果重复至少3次。

3 统计学处理

使用 SPSS 15.0 统计软件分析。所有实验结果重复至少3次，计量数据以均数±标准差(mean±SD)表示，组间均数比较采用单因素方差分析，依据方差齐性选用Tukey 或 Dunnett’s，见图2A 检验进行两两比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 CSE诱导HPAECs的活力下降

用 MTT 法检测发现1%、2.5%和5%的 CSE 处理12 h后HPAECs的活力下降不明显，10% CSE 处理12 h后与对照组相比差异具有统计学显著性(P<0.05)，见图1。故此后实验选取10% CSE处理细胞12 h作为实验条件。

Figure 1.The influence of different concentrations of CSE on cell viability. Dose-dependent effects and time-dependent effects of CSE on growth inhibition of human pulmonary artery endothelial cells were showed. Mean±SD.n=6.

图1 不同浓度CSE对细胞活力的影响

2 CSE可诱导HPAECs产生自噬

MDC可被细胞吸收并选择性聚集于自噬泡中，用荧光显微镜观察时可发现染上 MDC荧光的自噬泡呈绿色点状。CSE处理后，细胞自噬泡较正常组明显增多，见图2A。10% CSE作用12 h后，CSE组的LC3和beclin-1蛋白表达明显高于对照组，差异具有统计学意义(P<0.05),见图2B。

Figure 2.Autophagy of HPAECs in CSE group and control group. A: the image of MDC staining showed the formation of autophagy bodies; B: the results of Western blot detection showed the protein expression of beclin-1 and LC3. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group.

图2 CSE作用前后HPAECs自噬水平的比较

3 抑制自噬增加CSE诱导的 HPAECs 凋亡

本实验用Annexin V+/PI-及Annexin V+/PI+细胞数之和占细胞总数的百分比作为凋亡细胞占细胞总数的百分比。CSE组的细胞凋亡率与对照组比较差异具有统计学显著性(P<0.05)；3-MA预处理组细胞凋亡与对照组比较无明显差异;3-MA+CSE 组的凋亡率进一步增加，与 CSE组比较差异具有统计学显著性(P<0.05)，见图3。

4 抑制自噬促进CSE诱导的 HPAECs cleaved caspase-3蛋白水平增加

为进一步探讨自噬和凋亡之间的关系，应用自噬抑制剂3-MA处理细胞后，能明显抑制CSE引起的beclin-1表达上调和LC3-II/LC3-I比值上调，但caspase-3活化片段的蛋白量更高，见图4。

Figure 3.Apoptotic rate in each group analyzed by flow cytometry with Annexin V/PI staining. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vscontrol group.

图3 Annexin V/PI 流式细胞术检测各组细胞凋亡结果

Figure 4.The results of Western blot showed the changes of beclin-1, LC3 and cleaved caspase-3. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCSE group.

图4 Western blot 检测beclin-1、LC3和caspase-3活化片段的改变

讨 论

肺动脉内皮细胞衬于肺血管内腔表面，一方面维持血液的正常流动,起屏障作用，另一方面分泌血管活性物质，维持血管正常的张力、内环境稳定。肺动脉内皮凋亡可使上述稳态破坏，并引起肺血管平滑肌细胞及凋亡抵抗型内皮细胞的异常增生从而导致肺动脉高压[8-9]。既往研究认为，缺氧是导致肺血管重构的主要因素[10]。随着研究的深入，发现在无低氧血症的轻度 COPD吸烟患者同样发生了肺血管重构，提示香烟烟雾可能影响早期肺血管结构变化[8]。本研究将CSE直接作用于肺动脉内皮细胞，模拟吸烟后烟雾化学成分吸收进入血液循环的过程，结果发现CSE可以浓度和时间依赖性地引起肺动脉内皮细胞的凋亡，和正常对照组相比，10% CSE干预12 h可使HPAEC出现凋亡率明显增加。分子层面上，通过检测处于凋亡核心位置的死亡蛋白酶caspase-3发现，香烟烟雾提取物刺激HPAECs后可导致的caspase-3活化，这表明香烟烟雾暴露能够引起肺血管内皮细胞的凋亡。

自噬是机体一种重要的防御机制，细胞通过隔离膜包裹胞质中的蛋白或细胞器，形成封闭、双层的膜性结构，即自噬体。自噬体经过一系列步骤后成熟，通过与内体小泡融合，递送至溶酶体，最终，通过溶酶体蛋白酶降解其内容物[11]。故从本义上讲，自噬是机体保持内稳态和适应微环境重要的自我调节和保护机制。自噬与细胞死亡之间的关系十分复杂。在饥饿、缺氧等不利条件下,自噬对维持细胞存活具有积极作用，通过自噬，细胞能自我消化部分蛋白，帮助抵御一过性代谢压力。另一方面，高强度的自噬必然瓦解细胞结构，导致不可逆的功能丧失乃至死亡[4, 6]。

从自体吞噬角度研究肺血管损伤的病理过程目前积累的研究并不多。LC3是目前观察自噬现象是否存在，研究自噬活性较为可靠的生物学标志物。在细胞的自噬过程中，游离于胞质中的LC3-I 逐渐以LC3-II的形式定位于自噬小囊泡膜表面。因此，LC3-II转化水平可以反映细胞自噬发生的程度[12-13]。Beclin-1 蛋白是 JNK 信号转导通路的重要组成部分，通过其形成复合体，自噬相关蛋白被引导并定位于自噬体膜上，调控自噬前体的形成[14]。有研究显示，烟雾暴露后，COPD患者肺组织中自噬的标志蛋白LC3-II和beclin-1的表达升高。然而，Lee等[5]通过对慢性缺氧小鼠模型的研究发现，它通过调节缺氧环境下肺动脉内皮细胞的凋亡而在肺血管损伤中发挥保护性作用。本研究发现 HPAECs 经CSE处理后，本实验 MDC 染色结果表明 , 人肺动脉内皮细胞在 CSE作用 24 h 后有大量自噬空泡积聚，同时 LC3-II/LC3-I 的表达比例以及 beclin-1的表达明显增加，与 MDC 染色结果一致，提示CSE暴露可引起HPAECs发生自噬。

细胞自噬作为保守型程序性死亡方式，与凋亡的关系得到了广泛的研究，但暂无文献报道自噬在香烟烟雾暴露引发的肺动脉内皮细胞凋亡中的作用。鉴于此，本研究用特异性自噬抑制剂3-MA 预处理细胞，发现用 3-MA+CSE预处理后细胞的自噬泡明显减少，LC3-II/LC3-I 的表达比例和 beclin-1的表达水平明显下降，提示细胞自噬受到抑制。同时，伴随细胞活性的进一步下降，细胞凋亡率、cleaved caspase-3水平增加，提示自噬在CSE引起的 HPAECs 凋亡过程中起保护细胞的作用，抑制自噬后引起caspase依赖的细胞凋亡。

自噬与凋亡之间依生物学背景而变化的复杂关系有待于进一步研究阐明，本研究的结果发现CSE导致 HPAECs 通过caspase依赖的凋亡途径发生凋亡，且证实了细胞自噬在CSE引起的 HPAECs 凋亡起着保护性作用。本研究丰富了香烟烟雾暴露所致肺动脉内皮细胞凋亡的分子机制，为筛选防治烟雾暴露损伤可能的新分子靶标和临床药物开发提供新思路。

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(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

Autophagy is involved in pulmonary artery endothelial cell apoptosis induced by cigarette smoke extract

XUE Hong1, WANG Hong2, XU Neng-luan1, CHEN Yu-sheng1, SU Jian3, XIE Wei-ping2

(1DepartmentofRespiratoryMedicine,FujianProvincialHospital,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China;2DepartmentofRespiratoryMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity，Nanjing210029，China;3DepartmentofChronicDiseases,JiangsuProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanjing210009,China.E-mail:xuehong@fjsl.com.cn)

AIM: To investigate the role of autophagy in the apoptosis of human pulmonary artery endothelial cells (HPAECs) induced by cigarette smoke extract (CSE). METHODS: HPAECs were cultured routinely. HPAECs were treated with CSE at different concentrations, and the cell viability was detected by MTT assay. HPAECs were divided into control group, CSE group, 3-methyladenine (3-MA) group and 3-MA+CSE group. The autophagy was observed under fluorescence microscope with monodansylcadaverine (MDC) staining. Annexin V/propidium iodide staining and Hoechst 33342 staining were employed to detect apoptosis. In addition, the protein levels of LC3, beclin-1 and cleaved caspase-3 were determined by Western blot. RESULTS: MDC staining showed the increased production of autophagic vacuoles was observed in CSE group. The results of Western blot showed that the expression levels of autophagy-related proteins LC3 and beclin-1 were increased, while 3-MA pretreatment inhibited the expression of these proteins and the production of autophagic vacuoles. Observation with Annexin V/propidium iodide staining and Hoechst 33342 staining showed that the apoptotic rate in CSE group was significantly higher than that in control group, and pretreatment with 3-MA induced further increase in the cell apoptosis. The protein level of cleaved caspase-3 in CSE group was significantly higher than that in control group (P<0.05), and 3-MA+CSE treatment induced the further increase in the protein level of cleaved caspase-3. CONCLUSION: CSE induces autophagy and apoptosis in the HPAECs. Inhibition of autophagy promotes the apoptosis induced by CSE in HPAECs, which can be achieved through activation of caspase-3.

Autophagy; Human pulmonary artery endothelial cells; Cigarette smoke extract; Apoptosis

1000- 4718(2017)04- 0603- 05

2016- 10- 24

2017- 01- 13

福建省自然科学基金资助项目(No.2015J05143)； 福建省卫生计生委青年科研课题(No.2015-2-4)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.005

△通讯作者 Tel: 0591-88217531； E-mail: xuehong@fjsl.com.cn